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双光子显微成像技术是利用近红外的光子作为激发光源，长波长激发短波长发射。其吸收过程能够有效的降低生物体组织内的自发荧光和自吸收，有效地避免生物样品的光漂白及紫外可见光损伤现象，这些特点不仅能够提高组织和活体的穿透深度(>500μm)，同时也可延长观测的时间。由于它的独特优势，双光子显微成像已经广泛应用于细胞以及组织的微观成像。纳米材料由于其具有独特的小尺寸效应因而具有一些特殊的光、热、电、力学等性能。由于其较小的纳米尺寸以及较好的生物相容性，一些纳米材料可作为进入细胞的优良载体，在生物传感等方面得到广泛应用。基于纳米材料的独特性质，结合双光子显微成像的特殊优势，本论文的研究工作主要包括以下两个方面：（1）基于双光子染料标记核酸适配体（Aptamer-TPdye）/氧化石墨烯(GO)自组装及荧光共振能量转移的特性，设计了一种新型的双光子纳米复合探针，并用于检测体外及活体内三磷酸腺苷（ATP）。Aptamer-TPdye由于π-π共轭作用可与GO自组装，吸附在GO表面即形成GO/Aptamer-TPdye纳米复合物，由于双光子荧光团靠近GO表面而导致其荧光被淬灭。Aptamer-TPdye与ATP的结合力强于其与GO的结合力，将Aptamer-TPdye从GO表面竞争下来，伴随Aptamer-TPdye构型的变化，荧光团远离GO，荧光恢复。利用双光子显微成像的优势，从而实现复杂生物样品中ATP的灵敏检测，并成功应用于细胞及活体成像的研究。（2）基于以双光子染料标记的核酸（DNA-TP）为模板合成金银纳米合金的技术及高效的荧光能量共振转移原理，发展了一种新型DNA为模板的双光子纳米复合探针，并用于氰根离子（CN-）的检测。首先，以DNA-TP为模板，合成金银纳米合金。由于高效的荧光能量共振转移，DNA上的双光子荧光被有效淬灭。由于CN-对金银纳米合金的侵蚀作用，导致金银纳米合金颗粒逐渐变小，最后从DNA-TP模板上脱落下来，致使荧光恢复。该体系实现了对CN-的灵敏检测。