【实验研究背景】　　在全世界范围内，胃癌发病率高，大约是癌症总发病率的8%,是癌症致死的主要恶性疾病之一，是常见的恶性肿瘤。更为重要的是，约有70%的胃癌相关的死亡病例均位于不发达国家，尤其是东亚地区。在中国，肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌是男性和女性中5种最常见的高发肿瘤。胃癌的发生是宿主基因多态性、我们日常饮食或是吸烟等环境因素、表观遗传学改变等多种危险因素共同作用的结果。目前，幽门螺旋杆菌长期慢性感染胃粘膜上皮被认为是导致胃恶性肿瘤发生的最危险的因素，尤其是胃腺癌。但是幽门螺旋杆菌的致病机制并不清楚，已经报道的幽门螺旋杆菌如何与宿主基因相互作用影响胃癌的发生发展非常少。目前仍然有许多关键性的问题需要进一步探索。最近研究表明，细胞毒素相关抗原A蛋白(CagA)和细胞空泡毒素A（VacA)是幽门螺旋杆菌当中致病性最强的毒力因子，研究最为广泛。进入细胞内的 CagA蛋白能够异常激活 NF-κB、β-catenin等信号通路，促进细胞增殖、促炎性细胞因子产生及相关 miRNA的产生等细胞反应,参与致癌过程。　　虽然全世界有将近一半的人感染了幽门螺旋杆菌，却只有3%的感染人群最终发展为胃癌。这就说明幽门螺旋杆菌感染能否致病还依赖于与宿主基因的相互作用。表观遗传学包括点突变、剪切、复制、重组、与肿瘤相关基因的甲基化等等的改变,以及肿瘤抑癌基因的失活是从炎症转变为癌症的重要分子机制。胃癌的发生是幽门螺旋杆菌感染与细胞内抑癌基因之间相互作用的结果。　　miRNA是一类小的，非编码的 RNAs，它通过直接与靶 mRNA3′UTR结合，负向调控与肿瘤发生相关的癌基因或者抑癌基因的mRNA水平，促进癌症的发展。广泛的参与到了基因的转录后调控。有报道研究,miR-155是免疫反应和炎症反应的关键调控因素。但是，miR-155在幽门螺旋杆菌感染导致的胃疾病当中发挥了怎样的功能作用并不清楚，已有的报道也有相矛盾的地方。　　KLF4是一个含有锌指结构的转录因子。我们前期对 KLF4进行了研究，实验结果显示，过表达 KLF4明显的增加了细胞的凋亡；体内实验说明过表达KLF4抑制了胃癌增殖和侵袭，KLF4在胃癌中具有抑癌基因的作用。胃癌组织中KLF4蛋白表达较正常胃粘膜上皮明显降低，KLF4的表达和功能作用与胃癌的发生发展关系密切。但是KLF4在胃癌中表达异常的分子机制却不清楚。　　我们提出了以下假设：KLF4在胃癌中表达异常是不是由于幽门螺旋杆菌感染引起的？幽门螺旋杆菌中致病性最强的毒力因子CagA是如何与宿主基因KLF4相互作用，导致 KLF4在胃粘膜上皮细胞异常表达？KLF4在胃癌中表达异常是否可能由于miRNA靶向干扰KLF4表达？为了探索抑癌基因KLF4在胃癌中表达降低可能存在的分子机制，本课题在细胞水平上和临床病例相结合的方式进行实验验证。　　【实验研究方法】　　1、Western blot检测胃粘膜上皮细胞和胃癌细胞中 KLF4蛋白表达。将 HA标记的WT-CagA质粒转染进入GES-1细胞，通过转染不同的时间、不同的剂量，检测GES-1细胞中KLF4蛋白和mRNA表达。　　2、免疫组化方法检测胃癌组织和癌旁组织中KLF4蛋白表达。　　3、将 HA标记的 WT-CagA质粒转染进入 GES-1细胞，细胞行为学实验检测CagA对GES-1细胞恶性生物学行为的影响。　　4、搜集33例体检者和胃癌患者血清标本，提取血清中miRNA，用RT-PCR的方法检测 miR-155表达的差异性；原位杂交方法检测胃癌组织和癌旁组织中miR-155表达。　　5、RT-PCR检测胃粘膜上皮细胞和胃癌细胞株中 miR-155的表达。将 HA标记的WT-CagA质粒转染进入 GES-1中，提取细胞中总 RNA。用普通 PCR的方法，琼脂糖凝胶电泳观察CagA对miR-155表达的影响。　　6、在 GES-1细胞中瞬时转染 miR-155-3p minic和 miR-155-5p-minic，普通 PCR检测其对 KLF4 mRNA影响；通过转染不同的时间、不同的剂量，Western blot检测其对KLF4蛋白表达的影响；WT-KLF4 luciferase reporter和 MUT-KLF4 luciferase reporter与 miR-155 minic/NC共转染，48h后检测荧光素酶活性，从而对miR-155下游靶点的预测进行验证。　　7、建立稳定表达miR-155-5p-negative control& miR-155-5p minic的胃粘膜上皮细胞株 GES-1和胃癌细胞株 AGS。建立稳定表达 miR-155-5p-negative&miR-155-5p-inhibitor的胃癌细胞株SGC-7901。通过western blot实验分析稳定表达miR-155和敲低miR-155的细胞株中，KLF4蛋白表达。　　【实验研究结果】　　1、与正常的胃粘膜上皮细胞相比，胃癌细胞株当中KLF4蛋白表达明显降低；高表达CagA后很明显的降低了KLF4蛋白和mRNA表达，并且呈现出时间和剂量依赖性的抑制；　　2、免疫组化结果显示，胃癌组织当中KLF4的表达明显降低，且幽门螺旋杆菌感染的胃癌组织KLF4表达降低更为明显。　　3、幽门螺旋杆菌毒力因子 CagA的高表达促进了胃粘膜上皮细胞的增殖、迁移、平板克隆等恶性生物学行为的改变。　　4、与正常人的血清相比，胃癌患者血清标本中 miR-155的表达增高，尤其在TNM分期Ⅱ期和Ⅲ期更为明显；并且 miR-155表达的升高与幽门螺旋杆菌感染密切相关。miR-155在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织。　　5、细胞水平上，在胃上皮细胞 GES-1和恶性程度相对较低的胃癌细胞株 AGS表达相对较低，在恶性程度较高的胃癌细胞株中 miR-155表达水平相对较高；高表达CagA诱导了miR-155表达上调；　　6、荧光素酶报告基因证实KLF4可能是miR-155的靶基因。　　7、成功构建了稳定表达 miR-155-5p-negative control&miR-155-5p minic的胃粘膜上皮细胞株 GES-1和胃癌细胞株 AGS。建立了稳定表达 miR-155-5p-negative&miR-155-5p-inhibitor的胃癌细胞株SGC-7901。Western blot结果显示miR-155可能负向调控KLF4表达。　　【结论】　　CagA可能通过诱导miR-155表达，靶向干扰KLF4转录及翻译，抑制KLF4表达，从而促进胃粘膜上皮的恶性转化。