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桂枝汤为出自《伤寒论》的经典名方,由桂枝、芍药、甘草、大枣、生姜组成,主治外感风寒表虚证。本课题以桂枝汤为研究对象,建立大鼠血浆中桂枝汤多种有效成分(桂皮酸、芍药苷、马尿酸、甘草酸铵)LC-MS/MS检测方法,并进行大鼠体内的药代动力学研究,为进一步的研究提供基础。
一、大鼠血浆中桂枝汤多种有效成分LC-MS/MS检测方法研究
建立了大鼠血浆中桂枝汤多种有效成分的LC-MS/MS检测方法:取50μl血浆样品加入内标地西泮、1,8-二羟基葸醌,再加15μl1M盐酸酸化,用乙酸乙酯250μl萃取后取上清液,于37℃N2吹干,再用50μl流动相复溶,涡旋振荡3min,离心12000rpm×10min,取上清液20μl进行LC-MS/MS检测。以0.08％甲酸、4mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相,梯度洗脱,经AgilentC18柱(5μm,4.6mm×150mm)分离,流速0.6ml/min;以电喷雾离子化(ESI)方式,采用质谱多反映监测法(MRM),正负离子分时段检测,用于定量分析的离子反应分别为147.2→103.0(桂皮酸),479.0→449.1(芍药苷),178.0→133.8(马尿酸),471.6→149.2(甘草次酸),238.8→210.0(地西泮)和151.0→109.2(1,8-二羟基葸醌)。CUR为20psi,GS1为50psi,GS2为50psi,TEM为650℃。
本方法所有标准曲线线性良好(r＞0.995),桂皮酸线性范围为130-13000ng/ml,芍药苷线性范围为6-600ng/ml,马尿酸线性范围为600-60000ng/ml,甘草次酸线性范围为4-400ng/ml,最低定量下限分别为130ng/ml,6ng/ml,600ng/ml,4ng/ml。批间、批内RSD均小于10％,准确度的标准偏差在±10％以内。
二、大鼠血浆中桂枝汤多种有效成分药动学研究
SD大鼠6只,实验前禁食12h,不禁水,单次灌胃给予桂枝汤(7.9g/kg),以0.5％羧甲基纤维素钠溶液形式灌胃给药,灌胃后的0.017,0.25,0.5,1,2,4,6,8,12,24,36和48h于眼球后静脉丛采血,肝素抗凝,9600rpm,4℃下离心制备血浆,血浆保存在-70℃超低温冰箱中待测。采用LC-MS/MS法测定桂皮酸、芍药苷、马尿酸、甘草次酸的经时血浓度,其血药浓度-时间数据用DAS程序进行药代动力学分析,用统计矩法求算药代动力学参数。
结果：发现:桂皮酸、芍药苷、马尿酸和甘草次酸Tmux分别为:0.02±0.00h、0.46±0.10h、0.50±0.27h、11.33±6.77h,Cmux分别为:9231.67±5226.28mg/L、604.83±282.24mg/L、16550.00±2625.83mg/L、915.83±637.06mg/L,T1/2分别为:1.21±0.31h、1.87±1.05h、2.81±1.95h、6.56±2.54h,AUC(0-∞)分别为:7556.68±2384.44mg·h/L、1080.65±462.16mg·h/L、56535.09±33843.10mg·h/L、11589.64±5807.46mg·h/L。