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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二大神经退行性疾病,现无特效药进行治疗,表现以震颤、僵直和运动障碍为主。锰作为人体必需的微量元素存在于土壤、水和空气中,已有研究显示过量锰摄入能导致类帕金森病,但其具体机制鲜有报道。课题组前期通过体内外实验等研究证实随着锰浓度升高,大鼠全血、纹状体、皮质内Parkin m RNA水平降低,人骨髓神经母细胞瘤细胞内Parkin蛋白表达减少,因此本研究在前期研究的基础上进一步探究锰致神经系统损伤的机制。本研究分为2个部分,第一部分通过对SK-N-SH细胞以不同剂量染锰24h后检测细胞凋亡、DA含量、线粒体自噬功能相关指标和Parkin信号通路相关蛋白表达量,探究锰对SK-N-SH细胞活性、线粒体自噬功能、Parkin蛋白的影响;第二部分采用慢病毒转染SK-N-SH细胞以构建Parkin和OPTN基因过表达/敲低细胞模型,染锰24h后检测线粒体自噬功能相关指标和Parkin、OPTN蛋白表达量,研究Parkin在锰致SK-N-SH细胞线粒体自噬中的作用。第一部分锰对SK-N-SH细胞线粒体自噬及Parkin的影响目的:探讨不同锰浓度对SK-N-SH细胞线粒体自噬功能及Parkin蛋白的影响。方法:用CCK8法检测锰对细胞的增殖毒性后选择0、300、900和1500μmol/L Mn2+作为SK-N-SH细胞的染毒剂量。染毒24h,用Annexin V-PE/7-AAD双染测细胞凋亡,透射电镜观察细胞内自噬小体数量及线粒体形态,荧光探针检测细胞内ROS水平,JC-1探针检测线粒体膜电位改变,WB检测相关目的蛋白(α-syn、Parkin、Pink1、OPTN、LC3、P62),ELISA法检测细胞培养基中DA含量。结果:与对照组比较,细胞内自噬小体先增多后降低,线粒体形态随着锰浓度升高而变圆、嵴模糊不清、外膜不光滑等;细胞凋亡率、ROS含量随着锰浓度升高增加(P<0.05);线粒体膜电位、DA含量随着锰浓度升高逐渐降低(P<0.05);中、高剂量组α-syn蛋白增加(P<0.05);高剂量组OPTN蛋白表达量升高(P=0.02);低、中、高剂量组Parkin蛋白表达降低(P<0.05);高剂量组Pink1蛋白表达量下降(P=0.043);低剂量组LC3Ⅱ/Ⅰ增高(P<0.001),中、低剂量组降低(P<0.05)。结论:锰致SK-N-SH细胞损伤可能与线粒体自噬受阻、Parkin蛋白表达减少有关。第二部分Parkin在锰致SK-N-SH细胞线粒体自噬中的作用目的:以过表达/敲低Parkin和OPTN基因SK-N-SH细胞为模型,探讨Parkin在锰致SK-N-SH细胞线粒体自噬中的作用。方法:慢病毒转染SK-N-SH细胞构建Parkin和OPTN基因过表达/敲低细胞模型,分为(1)空载组、Parkin过表达组、Parkin敲低组;(2)空载组、OPTN过表达组、OPTN敲低组。以900μmol/L Mn2+对各组细胞染毒24h后,用电镜观察细胞内自噬小体数量,荧光探针检测细胞内ROS水平,WB检测相关目的蛋白(Parkin、OPTN、LC3、P62),ELISA法检测细胞培养基中DA含量。结果:(1)与空载组比较,Parkin过表达组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值均增加(P<0.05),ROS含量、P62和OPTN蛋白表达量降低(P<0.05);敲低组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值均减少(P<0.05),ROS含量、P62和OPTN蛋白表达量均升高(P<0.05)。(2)与空载组比较,OPTN过表达组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值均增加(P<0.05),P62蛋白表达量降低(P<0.05),Parkin蛋白表达量不变(P>0.05);敲低组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值均减少(P<0.05);P62蛋白表达量升高(P<0.05),Parkin蛋白表达量不变(P>0.05)。结论:Parkin能介导线粒体自噬增多以缓解SK-N-SH细胞锰毒性,OPTN蛋白可作为Parkin的自噬受体蛋白参与线粒体自噬。