防治南方根结线虫生防细菌及其活性挥发物的筛选、鉴定和初步应用

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根结线虫(Meloidogyne spp.)是危害农作物的重要病原生物,降低农作物产量和品质,对全球农业造成严重的经济损失。目前,根结线虫病的防治仍以化学防治为主。化学药剂的大量使用对环境安全和人畜健康造成了巨大威胁,多种化学农药也因此被限用或禁用,寻找环境友好、安全、无污染的防治方法迫在眉睫。生防制剂作为一种环境友好的化学药剂替代品逐步引起人们的重视。而生防细菌由于对线虫致死性强,易培养和生产,受到广泛关注。在我国,坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)已登记用于防治根结线虫病。但是商品化的优良菌株还比较少,不能完全满足需求,亟待筛选新的高效适用菌株。本研究从线虫病害发生严重的土壤中分离得到106株菌株,优选出8株具有杀线虫活性的菌株,鉴定了其种类,验证了菌株发酵液对根结线虫病的防治效果,鉴定了4株菌株产生的挥发性成分,并初步验证挥发物的杀线虫活性。主要结果概括如下:1.利用浸虫法通过测定菌株发酵液对南方根结线虫的室内毒力,筛选到DDWA、DDWB、DDWC、DDWD、DDWNEI、DDWWAI和JNC 7株菌株具有强杀线虫活性(线虫死亡率≥80%)及JNB 1株具有中等杀线虫活性(50%≤线虫死亡率<80%)。进一步利用熏蒸法确定DDWB、DDWNEI、DDWWAI和JNB 4株可产生具有强杀线虫活性的挥发性成分(线虫死亡率≥80%)。2.通过形态、生理生化和以16S rDNA和gyrB基因序列为引物的分子鉴定方法,确定以上8株细菌分别为耐盐芽孢杆菌B.halotolerans(DDWA)、芽孢杆菌B.kochii(DDWB)、海泥芽孢杆菌B.oceanisediminis(DDWC)、短小芽孢杆菌B.pumilus(DDWD)、东洋芽孢杆菌B.toyonensis(DDWNEI)、蜡样芽孢杆菌B.cereus(DDWWAI)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa(JNB)和假蕈状芽孢杆菌B.pseudomycoides(JNC)。3.移栽后混土处理盆栽试验中,海泥芽孢杆菌B.oceanisediminis(DDWC)2倍稀释发酵液(3×1012 CFU mL-1)对根结线虫病的防治效果最高,为69.96%,其次为东洋芽孢杆菌B.toyonensis(DDWNEI),为66.79%。田间试验中,在6×1012 CFU mL-1浓度下,菌株在2018年防效为49.98%-67.47%,其中芽孢杆菌B.kochii(DDWB)的防治效果最高,2019年防效为53.40%-66.79%,其中海泥芽孢杆菌B.oceanisediminis(DDWC)的防治效果最高。发酵液处理后,番茄产量可增加1.38%-26.19%。4.通过熏蒸法法确定4株细菌(B.kochii DDWB、东洋芽孢杆菌B.toyonensis DDWNEI、蜡样芽孢杆菌B.cereus DDWWAI、铜绿假单胞菌P.aeruginosa JNB)存在挥发性活性成分,进一步利用固相微萃取结合气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)推测各成分的种类及结构。鉴定得到挥发性活性成分属于烷烃、苯、酯、苯酚、醛、烯烃、醇、酮、酸和杂环类。5.购买并测定了10种上述挥发性化合物的杀线虫活性。1-十一醇,正辛酸甲酯,仲辛酮和4-氯苯丁酮等4种在小于12 mmol的浓度下,对南方根结线虫的致死率达100%,其LC50值分别为8.70、51.76、66.85、220.26 mg L-1。进行了1-十一醇,正辛酸甲酯和仲辛酮的盆栽熏蒸试验,结果1-十一醇在600 L ha-1的浓度下对根结线虫病的防效高达82.18%,正辛酸甲酯和仲辛酮在3000 L ha-1的浓度下对根结线虫病的防效分别为58.17%和73.98%。
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