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卵巢癌仍是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤,美国癌症协会2020年发布的数据显示,美国卵巢癌患者的总体5年生存率为48%,而晚期患者的5年生存率仅为29%。卵巢位于盆腔深处,由于起病隐匿,早期患者缺乏典型的临床症状和特异性肿瘤标志物,使75%以上卵巢癌患者在确诊时已处于晚期(III-IV期),已经发生了腹腔播散和/或远处转移,这也是导致其高致死率的主要原因之一。因此,更深入了解卵巢癌发生发展和转移的生物学过程,从而寻找更有效的监测指标和干预措施迫在眉睫。近年来,肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用受到了重视。腹水是包括卵巢癌在内的晚期腹膜内癌的特异性肿瘤微环境,与疾病的预后密切相关。腹水中含有大量的肿瘤细胞、间质细胞、各种活性因子和蛋白,后者主要负责细胞间信息的传递。成纤维细胞作为微环境中主要的间质细胞,可分泌多种促肿瘤因子,直接向邻近肿瘤细胞传递信号,促进细胞增殖、侵袭和转移,但其具体的作用机制亟待深入挖掘。我们前期采用LC-MS/MS无标记定量蛋白质组学技术及生物信息学分析,对正常人腹腔液和卵巢癌患者腹水中的差异蛋白进行筛选,结果发现两组间有49个分泌蛋白表达差异显著(差异倍数≥2或≤0.5),其中COL1A1蛋白在癌性腹水中的含量是正常腹腔液含量的4.8倍。本研究在此基础上,利用多种分子生物学技术,明确COL1A1蛋白的主要来源,观察COL1A1蛋白对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学功能的影响及其相关机制。旨在研究腹水中成纤维细胞来源的COL1A1活化肿瘤微环境促进卵巢癌转移的机制,为研发新的靶向药物和新的分子标记物,提供了实验依据。第一部分COL1A1对卵巢癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响目的:证实COL1A1对卵巢癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响,以及对免疫缺陷小鼠卵巢原位异种移植瘤腹腔转移的影响。方法:首先利用ELISA检测10例正常人腹腔液和27例高级别浆液性卵巢癌患者腹水中COL1A1蛋白的差异表达;其次用RT-PCR和Western blot检测成纤维细胞(IMR-90)和卵巢癌细胞(Caov3和SKOV3)胞内COL1A1 m RNA水平和蛋白水平,ELISA检测上清中COL1A1蛋白水平;之后CCK-8实验检测外源COL1A1蛋白对卵巢癌细胞增殖能力的影响;在存在或不存在COL1A1中和抗体的情况下,Transwell实验检测COL1A1蛋白或IMR-90细胞的培养上清液对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响;最后构建小鼠卵巢原位异种移植瘤模型,观察腹腔注射COL1A1蛋白对移植瘤生长和转移能力的影响。结果:1.ELISA结果证实COL1A1蛋白在上皮浆液性卵巢癌患者腹水中的表达高于正常人的腹腔液,差异具有显著性。2.与卵巢癌细胞Caov3和SKOV3相比,成纤维细胞IMR-90胞内显著高表达COL1A1 m RNA和蛋白,上清中高分泌COL1A1蛋白。3.外源COL1A1蛋白对卵巢癌细胞的增殖能力无影响。4.COL1A1蛋白或成纤维细胞IMR-90的条件培养基促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭,抗COL1A1抗体作用后卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力有所下降。5.在免疫缺陷小鼠卵巢原位异种移植瘤模型中,腹腔注射COL1A1蛋白加速了移植瘤的腹腔转移。结论:1.COL1A1蛋白在卵巢癌腹水中高表达且主要来源于成纤维细胞。2.COL1A1促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭以及小鼠卵巢原位异种移植瘤的腹腔转移,提示COL1A1在卵巢癌发展过程中发挥促癌作用。第二部分ITGB1/AKT信号通路参与COL1A1调控卵巢癌的迁移和侵袭目的:确定参与COL1A1调控卵巢癌迁移和侵袭的胞内信号通路。方法:首先通过Uniprot、String蛋白数据库分析以及文献查阅,筛选可能将COL1A1细胞外信号传递至癌细胞内的受体,并用RT-PCR检测Caov3和SKOV3细胞中受体m RNA水平的相对表达量。之后应用si RNA调控受体ITGB1和CD44的蛋白表达,再加入COL1A1蛋白作用于卵巢癌细胞,Transwell检测沉默受体后COL1A1蛋白对癌细胞迁移和侵袭能力的影响;同理抗ITGB1抗体BV7预处理卵巢癌细胞后,再加入COL1A1蛋白,Transwell检测抗体BV7阻断ITGB1受体的结合位点后COL1A1蛋白对癌细胞迁移和侵袭能力的影响。最后通过Western blot和细胞免疫荧光实验,检测COL1A1蛋白刺激卵巢癌细胞后,胞内整合素相关信号通路AKT磷酸化水平的改变;si RNA沉默或抗体BV7阻断卵巢癌细胞ITGB1受体后,再加入COL1A1蛋白,Western blot检测AKT磷酸化水平的改变;以及AKT的小分子抑制剂MK-2206抑制其磷酸化后,再加入COL1A1蛋白,Western blot检测AKT磷酸化水平的改变,Transwell检测卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的改变。结果:1.沉默ITGB1可部分抑制COL1A1促卵巢癌细胞迁移和侵袭的能力。2.阻断ITGB1可部分抑制COL1A1促卵巢癌细胞迁移和侵袭的能力。3.Western blot和细胞免疫荧光实验结果均证实COL1A1蛋白激活了AKT的磷酸化。4.沉默或阻断ITGB1可部分抑制COL1A1蛋白促AKT磷酸化的作用。5.AKT抑制剂MK-2206抑制COL1A1蛋白促AKT磷酸化的作用以及促卵巢癌细胞迁移和侵袭的能力。结论:COL1A1通过激活ITGB1/AKT信号通路促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭。第三部分卵巢癌腹水及其中的Fibrinogen调控成纤维细胞COL1A1的分泌目的:探讨影响卵巢癌腹水中成纤维细胞来源的COL1A1过度分泌的因素。方法:首先将三例卵巢癌患者的腹水分别用MEM培养基稀释至不同百分比(0%、25%、50%、75%)并作用于成纤维细胞,ELISA检测腹水作用后成纤维细胞上清液中COL1A1蛋白的分泌量;接着回顾第一部分非标记定量蛋白质组学测序芯片结果,发现fibrinogen蛋白在卵巢癌腹水中表达增加,用ELISA检测10例正常人腹腔液和27例浆液性卵巢癌患者腹水中fibrinogen蛋白的表达,并同腹腔液中COL1A1蛋白的表达进行相关性分析;然后用不同浓度的外源fibrinogen蛋白作用于成纤维细胞,ELISA检测培养上清液中COL1A1的蛋白含量;最后为验证fibrinogen蛋白的细胞来源,ELISA检测了卵巢癌细胞培养上清液中fibrinogen的含量;在未检测到fibrinogen蛋白的前提下猜测其可能来源于血浆fibrinogen的外渗,并通过体外内皮细胞通透性实验,检测卵巢癌细胞的条件培养基对血管内皮细胞通透性的影响。结果:1.卵巢癌腹水促进成纤维细胞分泌COL1A1蛋白,且fibrinogen蛋白在卵巢癌腹水中的表达显著高于正常的腹腔液。2.正常的腹腔液和卵巢癌腹水中fibrinogen和COL1A1的表达呈正向线性相关,fibrinogen蛋白可促进成纤维细胞分泌COL1A1蛋白。3.卵巢癌细胞的培养上清液中未检测到fibrinogen蛋白,但癌上清液可以增强血管内皮细胞的通透性。结论:1.卵巢癌腹水及其中的fibrinogen蛋白促进成纤维细胞分泌COL1A1蛋白。2.卵巢癌腹水中fibrinogen的增加,可能与卵巢癌细胞增强血管内皮通透性致血浆纤维蛋白原外渗有关。