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目的:新生儿坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis,NEC)是早产儿常见的消化道进展性疾病,其发病机制不明,但与肠道屏障功能破坏密切相关。课题组前期实验证明,乳凝集素可通过调节肠道紧密连接蛋白,降低大鼠肠道屏障的通透性。本研究拟通过检测乳凝集素对肠道紧密连接蛋白(Claudin-3和Occludin)的表达和分布,及肠道屏障修复相关蛋白(TLR4)表达等的影响,探讨乳凝集素在改善NEC中的作用及可能机制。方法:第一部分动物实验:(1)动物分组:一日龄新生大鼠被分为母乳组(DF组)、NEC模型组(N组)和NEC+rh MFG-E8组(N+M组),采用缺氧冷应激+配方奶侵袭性喂养的方法建立NEC模型,而N+M组在建立NEC模型的基础上予以rh MFG-E8 100μg/天。(2)小肠形态学检查:喂养96h后,处死新生大鼠,并观察肠道外观形态,取小肠回盲部组织,进行组织病理学以及透射电镜检查。(3)肠道通透性检测:各组新生大鼠于喂养结束后予以FITC标记的葡聚糖(FD10S),5h后采血,检测血清中FITC的浓度来评估肠道屏障通透性。(4)肠道紧密连接蛋白表达分布水平检测:通过Western blot、q RT-PCR和免疫组化的方法检测小肠回盲部CLDN3和Occludin的分布情况。(5)肠道TLR4表达水平检测:通过Western blot和q RT-PCR检测小肠回盲部TLR4的表达情况。第二部分细胞实验:(1)细胞分组:将IEC-6细胞分为PBS组(P组,对照组)、LPS组(L组,添加LPS 50μg/ml)和LPS+rh MFG-E8组(L+M组,在LPS组的基础上添加rh MFG-E8 2μg/ml)。(2)细胞通透性检测:利用transwell小室构建单层细胞模型,分组培养24h后上室内添加FD10S,5h后取下室内液体检测FD10S的浓度评价各组细胞通透性。(3)细胞紧密连接蛋白的表达分布水平:细胞分组后培养24h,采取免疫荧光、Western blot和q RT-PCR检查观察CLDN3、Occludin和ZO-1蛋白的表达分布情况。(4)划痕实验:细胞分组后,采取划痕的方法构建模型,记录各组细胞于不同时间点(0h,6h,12h和24h)的迁移距离,评估迁移能力。结果:第一部分动物实验:(1)乳凝集素对NEC新生大鼠临床症状的影响N组的新生大鼠最早出现喂养不耐受(包括胃残余量增加,进奶量下降等)、大便性状改变等症状。添加rh MFG-E8后,与N组相比较,新生大鼠的胃残余量减少,进奶量增加。(2)乳凝集素对NEC新生大鼠小肠回盲部形态学影响与N组相比较,添加rh MFG-E8的N+M组新生大鼠小肠回盲部轻中度积气,未见节段性黑红色坏死灶,其组织病理学评分及NEC阳性率显著降低(P<0.05)。透射电镜下,N组新生大鼠小肠回盲部肠黏膜隐窝部上皮细胞空泡化明显,细胞质呈深色,胞浆浓缩,细胞体积缩小,细胞间结构松散,可见典型凋亡细胞。而N+M组仅见细胞核染色质出现不同程度的积聚,核膜边集,线粒体肿胀。(3)乳凝集素对NEC新生大鼠肠道通透性及CLDN3、Occludin和TLR4表达分布的影响与N组相比较,N+M组新生大鼠肠道通透性显著降低(P<0.05),CLDN3胞内分布由胞浆内弥散分布变为在胞膜上浓聚。同时,其小肠回盲部TLR4表达水平较N组显著降低(P<0.05)。第二部分细胞实验:(1)乳凝集素对LPS处理后IEC-6细胞通透性和紧密连接蛋白表达分布水平的影响与LPS组相比较,L+M组表观渗透系数(Papp)显著降低(P<0.05),趋近P组,其CLDN3的表达水平显著降低(P<0.05),同时ZO-1由胞浆内弥散分布变为在胞膜上浓聚表达。(2)乳凝集素对LPS处理后IEC-6细胞迁移能力的影响与LPS组相比较,添加rh MFG-E8的L+M组于给药后12h时间点的水平迁移距离显著增加(P<0.05),趋近P组。结论:(1)乳凝集素能够改善NEC新生大鼠小肠回盲部外观形态、组织学评分及超微结构,降低NEC的发生率和严重程度。(2)乳凝集素能使NEC新生大鼠小肠回盲部CLDN3蛋白重新分布,使其在细胞膜上浓聚,同时降低TLR4的表达水平,从而降低肠道通透性,提高肠道损伤修复能力,维持肠道屏障的稳态。(3)乳凝集素能降低LPS处理后的IEC-6细胞CLDN3蛋白表达水平,同时使ZO-1蛋白重新分布,使其在细胞膜上浓聚,从而改善细胞通透性。(4)乳凝集素能增强经LPS处理后IEC-6细胞的迁移能力,从而促进肠上皮细胞修复能力。