论文部分内容阅读
第一部分依达拉奉在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用及机制目的:抑郁症是一种严重危害人类健康的精神疾病,其发病机制复杂多样,氧化应激和炎症是抑郁症的重要病理机制之一。依达拉奉（edaravone,EDA）是一种临床上用于治疗急性脑卒中的药物,具有抗氧化应激、抗炎症和保护神经的作用。部分研究表明,患者使用EDA可以改善情绪,然而,EDA抗抑郁的分子机制仍不清楚。本研究旨在研究EDA对慢性社会挫败应激（chronic social defeat stress,CSDS）诱导的小鼠抑郁样行为中的作用及机制。方法:1.使用CSDS模型诱导小鼠产生抑郁样行为。通过社会交互（social interaction,SI）、糖水偏好实验（sucrose preference test,SPT）、旷场实验（open field test,OFT）、高架十字迷宫（elevated plus maze,EPM）、悬尾实验（tail suspension test,TST）、强迫游泳实验（forced swimming test,FST）和新物体识别（novel object recognition,NOR）评估小鼠抑郁样行为、焦虑样行为和学习记忆能力。2.收集小鼠海马（hippocampus,Hip）和内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,m PFC）组织用于尼氏染色、免疫荧光染色、靶向能量代谢组学、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity,T-AOC）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）的测量。3.使用Western blotting（WB）和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测Hip和m PFC脑区沉默信息调节因子2相关酶类1（silent information regulator 2 homolog 1,Sirt1）、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1,HO-1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,Gpx4）的表达。4.腹腔注射EDA和Sirt1抑制剂EX527或Nrf2抑制剂ML385,观察其对小鼠抑郁样行为的作用及机制。应用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体下调Hip区Gpx4的表达,观察其对小鼠抑郁样行为的调控。结果:1.腹腔注射EDA逆转CSDS诱导小鼠的焦虑和抑郁样行为,表现为社交比率（p＜0.05）、糖水偏好（p＜0.05）、OFT中心区域的运动时间（p＜0.01）和EPM开臂活动时间显著增加（p＜0.05）,TST和FST的不动时间显著减少（p＜0.05）。2.EDA减轻由CSDS诱导小鼠Hip和m PFC脑区神经元丢失、小胶质细胞的活化、星形胶质细胞功能障碍、氧化应激损伤、能量代谢障碍和促炎因子的活化。3.CSDS模型小鼠Hip脑区Sirt1（p＜0.05）、Nrf2（p＜0.05）、HO-1（p＜0.001）和Gpx4（p＜0.001）的蛋白表达水平显著下调,该变化被EDA逆转。4.使用Sirt1抑制剂EX527降低Hip脑区的Sirt1（p＜0.01）、Nrf2（p＜0.01）、HO-1（p＜0.001）和Gpx4（p＜0.01）的蛋白水平,阻断EDA的抗抑郁作用。5.腹腔注射Nrf2抑制剂ML385降低Hip脑区的Nrf2（p＜0.001）、HO-1（p＜0.01）和Gpx4（p＜0.01）的蛋白表达,但对Hip脑区Sirt1的蛋白表达没有影响,阻断EDA的抗焦虑和抗抑郁作用。6.沉默Hip脑区Gpx4基因,阻断EDA的抗焦虑和抗抑郁作用。结论:EDA有抗焦虑和抗抑郁作用,可以减轻小鼠焦虑和抑郁样行为。Sirt1/Nrf2/HO-1/Gpx4信号通路可能是EDA上述作用的重要分子机制。第二部分 Gpx4在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用及机制目的:Gpx4,又称为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx）,它是一种抗氧化酶,是谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-PX）家族的第4位成员。它减少脂质过氧化物转化为脂质醇,这对于维持细胞的脂质稳态十分重要,减少有毒的脂质过氧化物积累,进而阻止铁死亡。已经证实,铁死亡和多种神经系统疾病密切相关,如阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）、创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）、癫痫和脑卒中等。但是,目前仍然缺乏铁死亡参与精神疾病,尤其是抑郁症研究的报道。Gpx4缺失是铁死亡的重要特征,因此本部分旨在探究Gpx4在抑郁症中的作用及机制。方法:1.使用ELISA方法检测抑郁症患者和CSDS模型小鼠血清中Gpx4的含量。2.通过CSDS模型诱导小鼠抑郁样行为。采用WB方法检测小鼠抑郁相关脑区Hip、m PFC、伏隔核（nucleus accumbens,NAc）、杏仁核和下丘脑中Gpx4蛋白的表达。3.构建以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）为载体的Gpx4过表达病毒,采用脑立体定位注射的方式将病毒注射至小鼠Hip脑区,造模后观察抑郁样行为学的改变,检测铁死亡相关指标丙二醛（malondialdehyde,MDA）、SOD和GSH-PX的变化。4.构建Gpx4基因沉默病毒,注射至小鼠Hip脑区,采用阈下社会挫败应激（subthreshold social defeat stress,SSDS）模型,检测对小鼠应激易感性的影响。5.对注射Gpx4沉默病毒和对照组小鼠进行转录组学检测,使用生物信息学方法分析差异表达基因并预测Gpx4的下游靶点。结果:1.抑郁症患者和CSDS敏感小鼠血清的Gpx4水平相比对照组显著降低。2.检测抑郁相关脑区Gpx4的蛋白表达,在CSDS敏感鼠中,仅有Hip脑区的Gpx4表达显著降低（p＜0.001）,m PFC、NAc、杏仁核和下丘脑Gpx4的表达相比对照组无明显差异。3.Hip脑区注射Gpx4过表达病毒,阻断CSDS诱导的小鼠抑郁样行为,包括社交比率显著升高（p＜0.01）、糖水摄取明显增加（p＜0.05）以及强迫游泳中小鼠的不动时间显著减少（p＜0.05）。CSDS模型叠加Gpx4对照组病毒,小鼠Hip脑区MDA含量显著升高（p＜0.001）,CSDS模型叠加Gpx4过表达病毒,MDA含量下降（p＜0.05）;SOD（p＜0.01）和GSH-PX含量显著升高（p＜0.05）。4.Hip脑区注射Gpx4的沉默病毒,小鼠的应激易感性增强,出现社交回避行为（p＜0.01）,糖水偏好率显著降低（p＜0.01）。小鼠在强迫游泳中不动时间显著增多（p＜0.05）。5.生物信息学分析,内质网应激相关蛋白可能是Gpx4参与抑郁症的下游靶点。结论:Gpx4作为铁死亡的核心分子,在CSDS诱导的抑郁样行为中发挥重要作用,内质网应激相关蛋白可能是Gpx4参与抑郁症的下游靶点。