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膜联蛋白(Annexin)是一种一钙离子依赖的方式与负离子磷脂结合的蛋白家族,在从真菌到高级脊椎动物的超过65个物种中总共鉴定出160多种独特的膜联蛋白。其中膜联蛋白5(annexin5, A5)是膜联蛋白家族成员中含量最丰富的蛋白,约占细胞总蛋白的1%,其分子量约36kD。已有研究表明annexin5具有多种功能,如抗凝血、具有钙离子通道活性、抑制磷脂酶A2和蛋白激酶C的活性,可能参与胞吞和胞吐作用等。Kawaminami等研究发现annexin5存在于大鼠的甲状腺、肾上腺、卵巢、睾丸等内分泌器官,并呈细胞特异性分布。本实验室先前的研究已经证实,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)能上调大鼠睾丸间质细胞中annexin5和3β-HSD在mRNA水平的表达,且睾酮水平也有显著提高。另有研究发现,重组的大鼠annexin5能以时间和剂量依赖性促进睾酮分泌,ERK MAPK是annexin5调控睾酮合成的关键信号通路,且annexin5是通过影响P450scc,3β-HSD和17β-HSD的表达来调节睾酮合成的。在体实验也已经证实,腹腔注射annexin5能促进SD大鼠睾酮分泌,并呈剂量依赖性,是通过提高P450scc和3β-HSD两种关键酶的表达来实现,提示annexin5可能是一种重要的生殖内分泌调节因子,在GnRH调节睾酮合成过程中起着重要作用。为了进一步研究annexin5在生殖系统中的作用,我们建立了annexin5刺激大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的差异蛋白谱,探讨annexin5调控大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌和增殖的具体机制。本实验共分四大部分：第一部分,通过原代培养大鼠睾丸间质细胞(Leydig cell),用一定剂量的annexin5(1nmol/L)作用24h后,与对照组(等量的pH8.0Tris-HCl)相比,加药组细胞中睾酮的含量升高了24%,提取细胞蛋白用二维电泳分离蛋白并进行比较。选择与对照组有明显差异表达的蛋白点,进行质谱分析。获得了分辨率和重复性均很好的annexin5刺激大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的差异蛋白谱。筛选出的可能影响睾丸间质细胞合成睾酮与增殖过程中的显著差异的关键表达的50个蛋白点,共有36个蛋白点被成功鉴定,其中加药组中上调表达的为23个,下调表达的为13个。第二部分：探讨annexin5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中类固醇急性调节蛋白相关脂类转运体结构域7(StarD7)表达的影响。用三种不同剂量的annexin5(0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L)作用于原代培养的大鼠睾丸间质细胞24h后,与对照组相比,annexin5终浓度为0.1nmol/L、1nmol/L时,实验组细胞中睾酮的含量分别升高了34%(P<0.05)、60%(P<0.01),结果均有显著性差异,而终浓度为10nmol/L时,实验组细胞中睾酮的含量虽也有升高,但与对照组比较,结果无统计学意义。运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(western blotting)方法检测annexin5对StarD7在mRNA水平和蛋白水平表达的影响。结果发现在nRNA水平上,与对照组相比,annexin5终浓度为0.1nmol/L、1nmol/L时,实验组细胞中StarD7的]mRNA目对表达量分别升高了53%、62%,结果均有显著性差异(P<0.01)；发现在蛋白水平上,与对照组相比,annexin5终浓度为1nmol/L时,实验组细胞中StarD7蛋白的相对表达量升高了44%(P<0.05),且睾酮分泌与StarD7蛋白表达之间呈显著正相关r=0.550(P<0.05)。运用免疫细胞化学(Immunocytochemistry)方法检测|StarD7在细胞中定位以及变化情况。发现StarD7主要定位在大鼠睾丸间质细胞的胞浆内,1nmol/L annexin5加药组的染色强度明显强于对照组。第三部分：探讨annexin5对大鼠睾丸间质细胞增殖过程中上皮细胞转化因子2(Ect2)表达的影响。用三种不同剂量的annexin5(0.1nmol/L、1nmol/L、10nmol/L)作用于原代培养的大鼠睾丸间质细胞,我们分别从annexin5对大鼠睾丸间质细胞增殖的影响与Ect2表达这两个方面进行研究,首先运用MTT检测细胞增殖活力以及流式细胞术检测细胞周期,MTT结果表明,annexin5对大鼠睾丸间质细胞有明显的促进增殖作用,且呈显著的剂量—时间依赖关系(P<0.01)；流式细胞分析发现,1nmol/L annexin5作用48h,G2/M期细胞减少到24.49%,72h减少到16.43%(P<0.05),说明annexin5促进睾丸间质细胞周期由G2期向M期的转变；运用RT-PCR和western blotting方法检测annexin5对Ect2在mRNA水平和蛋白水平表达的影响。结果发现在mRNA水平上,与对照组相比,annexin5终浓度为0.1nmol/L、1nmol/L时,实验组细胞中Ect2的mRNA相对表达量分别升高了15%(P<0.05)、27%(P<0.01)；发现在蛋白水平上,与对照组相比,annexin5终浓度为1nmol/L时,实验组细胞中StarD7蛋白的相对表达量升高了21%(P<0.05)；最后运用RT-PCR方法检测annexin5对细胞周期调控蛋白的影响,与对照组相比,annexin5终浓度为1nmol/L时,实验组细胞中cyclinB1、CDK1的mRNA相对表达量分别升高了25%和33%,结果均有显著性差异(P<0.05)。而cdc25c的mRNA相对表达量与对照组比较,结果无统计学意义。第四部分：探讨annexin5影响睾丸间质细胞睾酮合成与增殖的功能研究和调控机制。我们通过优化原代大鼠睾丸间质细胞的转染条件,且RNAi技术特异性沉默原代大鼠睾丸间质细胞annexin5表达后,分析其对原代大鼠睾丸间质细胞睾酮合成与增殖的影响,结果表明,siRNA干涉片段可以使annexin5蛋白水平下降了51%(P<0.05)。睾酮合成相关研究发现,与对照组相比,annexin5沉默后使睾丸间质细胞睾酮的含量下降了49%(P<0.01),同时细胞增殖相关研究发现,与对照组相比,annexin5沉默后使睾丸间质细胞增殖活力在2-5d被显著抑制(P<0.01), annexin5沉默睾丸间质细胞48h后,G2/M期细胞百分比显著上升(P<0.01)；S期细胞百分比显著下降(P<0.01)；再通过western blotting方法观察睾酮合成与增殖相关的StarD7和Ect2蛋白水平表达变化情况,与对照组相比,annexin5沉默后使睾丸间质细胞睾酮的StarD7和Ect2蛋白相对表达水平分别下降了50%(P<0.01)和28%(P<0.05)。由此我们得出结论：重组的大鼠annexin5促进原代大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌,其机制可能是促进StarD7与胆固醇结合,并介导胆固醇向线粒体内膜转运而实现的。annexin5对原代大鼠睾丸间质细胞的增殖有促进作用,并呈时间和剂量依赖性。并促进睾丸间质细胞周期由G2期向M期的转变,可能是通过调节细胞周期相关蛋白cyclinB1以及CDK1的表达来实现的,且Ect2可能参与调节annexin5调控睾丸间质细胞有丝分裂胞质收缩环的形成过程。