研究背景肝纤维化(liver fibrosis)是一种常见的慢性肝脏疾病,是由多种致病因子导致的肝内结缔组织异常增生的病理变化过程,其引起的死亡率在发达国家中约占45%,持续的肝纤维化可进一步发展为肝硬化或肝癌。多项研究表明,当消除这些导致肝损伤的致病因素时,肝纤维化是可以逆转的。尽管清除致病因素和控制炎症可在一定程度上抑制纤维化的进展,但目前临床上仍然缺乏安全有效、特异性针对肝纤维化的治疗措施。因此,进一步探讨影响纤维化形成的机制,对于防治肝纤维化的发生发展具有重要的临床指导意义。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是促进肝纤维化形成的主要效应细胞。这是由于受到肝损伤刺激后HSCs会转化为可产生细胞外基质蛋白(extracellular matrix,ECM)的成纤维细胞,进而导致ECM的沉积和纤维化形成。近来的研究表明,肝脏中多种免疫介质参与了对HSCs活化的调控。如,NK细胞、T细胞、单核/巨噬细胞等都可通过调控HSCs的活化影响肝纤维化的进展。其中,γδT细胞也是肝脏中富含的一群免疫细胞,其活化后快速增殖并释放多种效应分子,γδT细胞的这种特性可通过释放效应分子或以接触依赖的方式与其邻近细胞发生相互作用。但是,γδT细胞及其亚群与HSCs之间的相互作用及其在肝纤维化过程中的具体作用及确切的作用机制尚不清楚。因此,我们拟利用野生型(WT)小鼠和TCRδ-/-鼠建立CCl4诱导的肝纤维化模型并结合分子生物学、细胞生物学技术,探讨γδT细胞及其亚群γδT1和γδT17细胞在肝纤维化进展过程中的作用及机制。研究目的1.观察γδT细胞缺失对CCl4诱导的小鼠肝纤维化进程的影响2.分析肝纤维化发生后对肝脏中的γδT细胞的分布和数量的影响,分析γδT细胞对活化的HSCs的作用3.分析γδT细胞亚群(γδT1细胞和γδT17细胞)对活化的HSCs的作用4.观察γδT细胞是否通过影响其他免疫细胞而间接影响纤维化的进程。5.阐明γδT细胞及其亚群调控HSCs活化及肝纤维化进程的作用机制研究方法1.通过Real-time PCR和凝胶电泳成像技术确定TCRδ-/-鼠的基因型正确。2.利用CCl4腹腔注射法建立WT鼠和TCRδ-/-鼠肝纤维化模型。3.应用免疫组织化学法、血清ALT及羟脯氨酸水平检测分析γδT细胞缺失对肝纤维化程度的影响。4.通过流式检测技术分析纤维化后肝脏内γδT细胞比例和数量的变化。5.利用冰冻切片免疫荧光双染法检测γδT细胞在肝组织中的表达与定位。6、利用肝脏原位灌流及梯度密度离心法分离小鼠原代肝星状细胞,并建立培养-活化的HSCs细胞模型。7.通过体外共培养实验、LDH法观察肝脏γδT细胞NK细胞及其亚群对HSCs的细胞毒性。8.通过向在纤维化诱导过程中的TCRδ-/-鼠过继转输γδT细胞,观察γδT细胞对纤维化进程的影响。9.通过流式检测技术及免疫荧光法分析纤维化后肝脏γδT细胞及其亚群中细胞毒性相关效应分子的表达变化。10.在WT鼠和TCRδ-/-鼠纤维化诱导过程中,通过腹腔注射IL-17A阻断抗体和IFNγ阻断抗体,分析γδT细胞分泌IFNγ及IL-17对肝纤维化进程的影响。11.通过流式检测技术分析γδT细胞缺失对纤维化的肝组织中cNK细胞和lrNK细胞上细胞毒性相关分子表达的影响。12.利用流式检测技术分别检测纤维化后γδT细胞及cNK细胞和lrNK细胞共刺激分子CD137及其配体CD137L的表达变化。13.在体外共培养体系中,利用针对特定分子的阻断抗体,鉴定待测分子是否影响了γδT细胞或NK细胞对活化的HSCs的细胞毒性。实验结果1.γδT细胞缺失加重CCl4诱导的肝纤维化程度通过直观观察、组织学分析以及检测血清ALT和羟脯氨酸水平比较WT鼠与TCRδ-/-鼠纤维化程度的差异。结果显示,与WT鼠相比,TCRδ-/-鼠在经过腹腔注射CC14诱导肝纤维化后,其纤维化程度更严重。这提示我们γδT细胞在肝纤维化过程中发挥抑制纤维化的作用2.CCl4诱导的慢性肝损伤促进γδT细胞向纤维化的肝脏部位募集利用流式细胞术观察到,相比于正常肝组织,有大量γδT细胞向纤维化的肝组织部位募集;利用α-SMA和γδTCR免疫荧光抗体进行免疫荧光双染色实验的结果显示,在纤维化的肝组织中,γδT细胞(γδTCR+)与活化的HSCs(α-SMA+)存在共定位的现象。这提示纤维化过程中募集于肝脏的大量γδT细胞可能与HSCs存在相互作用。3.γδT细胞诱导活化的HSCs发生凋亡通过γδT细胞与活化的HSCs共培养,TUNEL染色法检测到γδT细胞可诱导活化的HSCs发生凋亡;通过LDH法检测到γδT细胞对活化的HSCs有明显的细胞毒性。通过γδT细胞的过继转输,发现与未接受γδT细胞治疗的对照组相比,TCRδ-/-在接受γδT细胞治疗后其纤维化程度显著减轻。说明γδT细胞在CC14诱导的肝纤维化进程中通过诱导HSCs凋亡发挥抑制纤维化的作用。4.慢性炎症促进γδT细胞上表达活化性受体NKp46通过比较纤维化前后肝脏γδT细胞上功能相关分子的表达变化,发现CC14介导的慢性炎症和纤维化明显促进肝脏γδT细胞上高表达活化性受体NKp46、凋亡诱导分子TRAIL和FasL,其细胞毒性颗粒的水平也显著提高。在γδT细胞与活化的HSCs的共培养体系中,利用阻断抗体分别阻断NKp46、TRAIL和FasL都显著降低γδT细胞对活化的HSCs的杀伤效率,而同时阻断这三个分子时γδT细胞对活化的HSCs的细胞毒性降低更加明显。这些结果表明,肝纤维化过程增强γδT细胞活化性受体NKp46的表达进而促进γδT细胞的活化和凋亡相关分子TRAIL、FasL的表达。活化的γδT细胞通过NKp46介导的细胞毒性颗粒的释放和死亡受体途径杀伤活化的HSCs。5.γδT1细胞对活化的HSCs细胞的细胞毒性强于γδT17细胞与分泌IL-17的γδT(γδT17)细胞相比,分泌IFNγ的γδT(γδT1)细胞上表达更高比例的NKp46、TRAIL、FasL和细胞毒性颗粒。γδT1细胞对活化的HSCs的细胞毒性明显强于γδT17细胞。而且,体内IFNγ抗体阻断,显著加重WT鼠的纤维化程度,而对TCRδ-/-鼠纤维化程度无明显影响;阻断IL-17对WT鼠和TCRδ-/-鼠的纤维化程度均无显著影响。提示在纤维化过程中γδT1具有更显著的抑制肝纤维化的作用。6.γδT细胞增强了肝内cNK细胞和lrNK细胞的抗纤维化能力lrNK细胞和cNK细胞均对活化的HSCs具有明显的细胞毒活性而发挥抑制肝纤维化的作用。TCRδ-/-鼠中的cNK细胞和lrNK细胞对活化的HSCs的细胞毒活性显著低于WT鼠,说明在纤维化诱导过程中γδT细胞可增强cNK细胞和lrNK细胞对活化的HSCs的细胞毒性。而且,γδT细胞缺失显著抑制lrNK和cNK细胞活化性受体NKp46、NKG2D、DNAM-1及相应的效应分子的表达。说明γδT细胞可通过增强NK细胞这些活化性受体的表达促进cNK细胞和lrNK细胞的活化及对活化的HSCs的细胞毒性,从而发挥间接的抗纤维化的作用。7.γδT细胞通过CD137/CD137L信号增强cNK细胞和lrNK细胞对活化的HSCs的细胞毒活性与对照组相比,纤维化小鼠肝内γδT细胞上高表达共刺激分子CD137的配体(CD137L);而肝内cNK细胞和lrNK细胞上CD137的表达也显著高于对照组。这提示纤维化肝脏中的γδT细胞CD137L的高表达可能通过与肝内cNK细胞和lrNK细胞所表达的CD137分子结合,向cNK细胞和lrNK细胞传递共刺激信号。在γδT细胞、NK细胞及活化的HSCs的共培养体系中,加入CD137L的特异性阻断抗体可显著抑制NK细胞对活化的HSCs的杀伤活性。说明γδT细胞可通过CD137/CD137L向cNK细胞和lrNK细胞传递共刺激信号,增强cNK细胞和lrNK细胞对HSCs的细胞毒活性,从而发挥间接的抗纤维化的作用。结论及意义1.本研究发现,在CCl4诱导的肝纤维化过程中,γδT细胞可通过杀伤活化的HSCs发挥抑制肝纤维化的作用。2.本研究首次发现,在CC14诱导的肝纤维化过程中,γδT1细胞亚群的抗纤维化能力显著强于γδT17细胞亚群。3.本研究首次发现,CCl4诱导的慢性炎症可促进γδT细胞活化性受体NKp46的表达,进而诱导γδT细胞的活化、增强γδT细胞对HSCs的细胞毒活性。4.本研究首次阐明了 γδT细胞发挥抗纤维化作用的两条途径:一方面,通过NKp46的表达诱导γδT细胞的活化,增强γδT细胞对HSCs的细胞毒活性,从而发挥直接的抗纤维化的作用。另一方面通过CD137L的表达向肝内cNK细胞和lrNK细胞传递共刺激信号,增强cNK细胞和lrNK细胞的活化和对HSCs的细胞毒活性,从而发挥间接的抑制肝纤维化的作用。