研究背景:黑色素细胞Melanocytes(MC),是脊椎动物皮肤、毛发着色的主要细胞,主要存在于表皮基底层,还有少量存在于毛囊;其功能缺失或者减弱,会导致白发、白癜风等一系列难治性脱色素性疾病发生。哺乳动物毛囊Hair follicle(HF)是表皮向真皮凹陷后形成的皮肤附属结构,其能控制毛发生长以及着色,且呈周期性变化,经历着生长期、退行期和休止期三个时期,其自我更新能力也比较强;其在维持内环境稳定、参与修复皮肤创伤、维持皮肤以及毛发的着色等过程中有着重要功能。作为一种容易获得的组织,其内有多种细胞可以用于再生医学,而其内的黑色素细胞就是一种与皮肤、毛发着色息息相关的细胞。在毛囊中,黑色素干细胞形成一种干细胞系统,能够逐步成熟并分化成HF-MCs,可以既可以向上迁移、分化形成表皮黑色素细胞,表皮中MC与周围的角朊细胞一起为每个周期循环中的皮肤着色提供“黑色素单位”;又可以向下迁移、分化形成定位于毛乳头上方的黑色素细胞,有活性的毛囊源性黑色素细胞既可以为毛发又可以为皮肤提供黑色素使其着色,随着毛囊的周期性循环,毛囊内的黑色素细胞(HF-MCs)也呈周期性的合成黑色素。相比于表皮中的黑色素细胞,体外培养毛囊源性MC不仅具有来源上的优势,而且在功能上也比表皮黑色素细胞更全面,能够从根本上解释色素的减退,一定程度上为色素障碍性疾病的治疗开辟了新的途径。再者,毛发颜色的减退并不能用表皮来源MC的理论解释,这就促使学者们更热衷于HF-MCs的研究。研究目的:建立皮肤毛囊源性黑色素细胞的分离、培养、纯化和扩增技术,为毛囊源性黑色素细胞生物学研究提供前期实验基础。研究方法:1、毛囊源性黑色素细胞定位取出生后11天处于生长期C57小鼠的皮肤,10%甲醛固定后,梯度酒精脱水,石蜡包埋。切成5μm厚,进行常规HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色、免疫组织化学染色。2、毛囊源性黑色素细胞分离、培养、纯化和鉴定取生长期C57乳鼠的背部皮肤全层组织,修剪成0.2cm*0.2cm大小;用Dispase II 4℃消化过夜后去除表皮。然后用0.1%I型胶原酶37℃下消化真皮组织1-2小时,反复吹打使毛囊从真皮中游离出来。1500rpm离心5分钟,获得毛囊,再用0.25%胰酶37℃下消化毛囊1-5分钟,获得毛囊来源干细胞(Hair follicle-derived stem cells,HF-SCs)。将HF-SCs用含有HMGS的MCs选择培养基M-254培养。采用RT-PCR、L-DOPA染色、免疫荧光染色和Western Blot以及流式细胞技术从m RNA水平、蛋白水平和形态上检测MCs特异基因、蛋白的表达。研究结果:HE染色,免疫荧光,免疫组织化学分析结果显示处于生长期的毛囊中存在黑色素细胞,成熟HF-MCs主要存在于真皮乳头上方,还有部分未活化的存在于外毛根鞘,而黑色素干细胞多存在于隆突部位;L-DOPA染色结果显示毛囊来源细胞培养至P3时,染色呈棕黑色阳性反应,细胞多呈两极状或者多角状,L-DOPA反应阳性;RT-PCR分析结果显示HF-MCs含有黑色素细胞的标志基因:MITF、TYR、TRP1等;免疫荧光、流式细胞术以及Western blot分析结果显示获得的细胞表达MITF、TYR、TRP1蛋白。结果证实,在选择培养基条件下培养的细胞具有黑色素细胞的形态,表达黑色素细胞的标志物,能够合成黑色素颗粒。结论:1、成功在体外分离、培养出毛囊源性黑色素细胞。2、经体外一系列鉴定实验表明,所培养的黑色素细胞表达MITF、TYR、TRP1等标志蛋白,成功培养出毛囊源性黑色素细胞。