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昆虫卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor, VgR)属于低密度脂蛋白受体,主要功能是通过胞吞作用介导卵黄原蛋白(Vitellogenin, Vg)进入卵巢,为卵母细胞的发育提供营养。目前为止,已经报道了21种昆虫VgR的cDNA及基因组序列,它们都具有典型的LDLR保守功能结构域。本小组已经报道了家蚕卵黄原蛋白受体(BmVgR)基因位于第20号染色体上,全长cDNA为5746bp。BmVgR作为卵巢特异的蛋白在雌性家蚕个体的整个生命周期中都有表达。家蚕vit突变体的产生是因为该品种的BmVgR基因缺失了一段150bp的编码序列,导致编码的BmVgR蛋白功能异常而不能正常转运卵黄蛋白,最终导致后期胚胎发育的营养缺乏而致死。同时,采用RNAi干涉正常雌性家蚕BmVgR,同样发现BmVgR基因下调对卵巢的发育产生了影响,即卵子不能形成或产生畸形卵,表明BmVgR在家蚕卵巢发育过程中具有重要的作用。本研究在获得家蚕卵黄原蛋白受体全长序列的基础上,利用基因克隆、原核表达、细胞表达、免疫组化、免疫共沉淀、Far-Western blotting等技术对家蚕的卵黄原蛋白受体的功能进行了初步探讨,主要研究结果如下：1.家蚕卵黄原蛋白受体的结构分析与克隆对已报道的21种昆虫卵黄原蛋白受体进行信息分析,结果发现21种昆虫物种的VgR结构图谱几乎一致,都具有两个拷贝的配体结合结构域(LBD1、LBD2)和表皮生长因子前体同源区域(EGFP1、EGFP2)。BmVgR与已报道的两种蚕蛾科昆虫(柞蚕(ApVgR)和绢丝蚕(AsVgR))的结构组成形式是一样的。将昆虫卵黄原蛋白受体进行进化分析显示,BmVgR与鳞翅目昆虫VgRs关系最近,聚为一簇；且蚕蛾科的家蚕、柞蚕及绢丝蚕的同源性最高,这与传统的物种进化关系一致。克隆BmVgR的LBD1和LBD2后,对其氨基酸序列分析显示：LBD1由4个配体结合重复区(LBRs)组成,并且每个LBR含有6个半胱氨酸残基；对LBD2的克隆发现LBD2具有5种不同拼接形式,即LBD2-(1-5),其中LBD2-2、LBD2-3及LBD2-4三种拼接形式表现为插入一段氨基酸序列,而LBD2-5则缺失了一段氨基酸序列。对LBD1和LBD2-(1-5)的氨基酸序列进行翻译后修饰位点预测,发现LBD1和LBD2-(1-5)都存在磷酸化位点,但只有LBD2-(1-5)存在糖基化位点。2.家蚕卵黄原蛋白和卵黄原蛋白受体抗体的制备对BmVg的ND肽段(N端含有大亚基的部分结构域)和BmVgR的YWTD肽段(EGFP1的部分结构域)进行克隆后原核表达,都是以包涵体形式表达了蛋白,对表达蛋白采用亲和镍柱纯化,其纯化蛋白由抗体公司免疫兔子得到了抗兔的多克隆抗体。BmVg和BmVgR抗体效价都大于1：512000,浓度分别为0.4mg/mL和0.26mg/mL,经抗原检测BmVg和BmVgR多克隆抗体都能较特异的结合相应抗原,这为后续的实验做好了准备。3.家蚕初期蛹血液中卵黄原蛋白的纯化将家蚕初期蛹血液进行硫酸铵分级沉淀后,利用SDS-PAGE检测,发现BmVg土要集中在40%-60%的硫酸铵饱和溶液组分中,对该组分采用阴离子交换层析,经过蛋白透析、浓缩,最终得到了较纯的蛋白,即浓度为0.1mg/mL。用BmVg多克隆抗体进行Western blotting检测纯化后的BmVg蛋白,结果蛋白条带单一,且蛋白分子量大小与预期一致。由此,确认了所纯化获得的蛋白的确是BmVg,且纯度达到了后续BmVgR结合实验要求。4.家蚕卵黄原蛋白受体与卵黄原蛋白的结合与解离构建了分别含野生型和vit突变型家蚕卵黄原蛋白受体的第一个拷贝的功能域即包含了信号肽、第一个配体结合结构域和第一个表皮生长因子结构域(SP+LBD1+EGF1)的细胞表达载体(p50：C11D,d50：C11V)。转染到草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞系中进行表达,结果目的蛋白主要分泌在细胞培养液中。通过免疫荧光检测,结果C11V和C11D蛋白在Sf9昆虫细胞系中的表达量相当,二者并没有明显差异,说明vit突变体的BmVgR在细胞水平上是可以正常表达的。为了能确定一个BmVgR和BmVg在体外解离的pH值,本研究先确认了BmVgR和BmVg解离的生物环境的pH值,即对不同蚕卵pH值进行测定,结果蚕卵内的pH值显示卵内的生物环境一般为酸性,即在5.1-6.3。将在Sf9细胞中表达获得的C11D和C11V蛋白分别与纯化的BmVg进行免疫共沉淀,结果发现在中性环境中,C11D和C11V蛋白的结构域都能结合BmVg;在酸性环境中,BmVg能从正常的C11D结构域蛋白上解离,但几乎不能从突变的C11V结构域蛋白上解离,说明vit突变体中BmVgR的第一个EGF的第三个ClassB的缺失对BmVgR结合配体蛋白没有影响,但在生理酸性条件下是不能与配体解离,最终导致突变体vit卵中缺乏BmVg蛋白。5.家蚕卵黄原蛋白受体与不同配体的相互作用对BmVgR的LBD1和LBD2结构域进行细胞表达载体构建,并在Sf9细胞中表达。将表达蛋白经过细胞裂解处理,并进行简单粗纯化。经纯化的LBD2的三种形式即LBD2-1、LBD2-4及LBD2-5的表达蛋白与纯化的BmVg进行结合实验,然后采用Far Western blotting检查发现,这三种形式的蛋白都能与BmVg结合,其结合能力的比较还需要进一步的实验分析。将LBD2三种形式的表达蛋白与纯化的4种30K蛋白结合,暂时没有得到明确结果,还需要进一步的实验探讨。