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慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是由异常费城染色体的出现引起的恶性的克隆造血干细胞疾病，通常，CML从慢性期（chronic phase,CP）开始到加速期（accelerated phase,AP），然后在称为急变期（blast crisis,BC）的终末期（terminal phase,TP）结束。具有未分化状态的高度增殖是CML肿瘤发生的共同特征，促进白血病细胞的正常分化已经变成临床上治疗多种血液恶性肿瘤的新型治疗策略。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）在临床上可成功治疗急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL），但由于严重的耐药性，肝肾毒性等问题，在临床上的应用受到了一定的限制。故本课题组以ATRA为先导化合物，设计合成了一系列新型的维甲酸衍生物。其中，4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)被证实在体外可以诱导肿瘤细胞分化并且抑制增殖过程，但其作用的具体分子机制仍旧有待阐明。 为了进一步地研究ATPR诱导CML细胞分化的可能机制以及真核翻译起始因子eIF3a在ATPR诱导分化过程中的作用，本研究选用K562细胞株进行实验，体外观察在ATPR对于eIF3a表达的影响以及eIF3a在ATPR诱导K562细胞分化的过程中所发挥的作用。本课题的研究内容可分为以下4个部分。 1.eIF3a在白血病人体内的表达水平 eIF3a作为真核翻译起始因子，已经被证实可以作用于特定mRNA的翻译起始过程，影响细胞的增殖和分化等生物学过程。但至今未有报道其在白血病细胞中的表达状况。本研究采用qRT-PCR和western blot分析了CML患者和正常人外周血中eIF3a的蛋白和mRNA水平。结果显示，CML患者eIF3a的蛋白表达显著高于正常对照组。qRT-PCR分析也证实了CML患者中eIF3a的mRNA表达显著增加。 2.ATPR对于K562细胞中eIF3a表达以及细胞周期的影响 采用不同浓度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M)和不同时间点(0、24、48、72h)的ATPR对于K562细胞进行处理，western blot分析eIF3a在不同条件下的表达变化，同时确定ATPR作用的最佳条件；给予ATPR(10-6 M)作用于K562细胞72h后，使用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果提示：ATPR可以在体外抑制K562细胞中eIF3a的表达，其中药物在作用浓度为10-6 M，作用时间为72h时效果较为显著；同时流式结果表明ATPR可以阻滞K562细胞于G1期。 3.eIF3a在ATPR诱导K562细胞分化过程中的作用 将过表达质粒pEGFP-N1-eIF3a转染进入K562细胞中，再使用ATPR(10-6 M)对转染后的K562细胞进行刺激，使用western blot技术对于细胞中eIF3a、cyclinD1、c-myc、p-Raf-1和p-ERK蛋白表达量进行检测；使用瑞吉氏染色检测细胞的形态学变化；使用流式细胞仪检测细胞表面髓系分化抗原CD11b和CD14的表达变化。结果显示：过表达eIF3a可以促进ATPR所抑制的K562细胞中cyclin D1和c-myc的表达量，而p-Raf-1和p-ERK的表达量变化正好相反。同时过表达eIF3a也可以抑制ATPR诱导的K562细胞向成熟细胞分化的形态学改变以及K562细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达。 为了进一步证实eIF3a的作用，使用eIF3a siRNA下调K562细胞中eIF3a的表达，再使用ATPR(10-6 M)处理细胞72h，使用western blot技术对于细胞中eIF3a、cyclin D1、c-myc、p-Raf-1和p-ERK蛋白表达量进行检测；使用瑞吉氏染色检测细胞的形态学变化；使用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD11b和CD14的表达量变化。结果显示：沉默eIF3a可以使K562细胞中cyclin D1、c-myc的表达量下降，同时促进p-Raf-1和p-ERK的表达。并且沉默eIF3a可以促进ATPR诱导的K562细胞形态向成熟方向分化以及上调K562细胞中表面分化抗原CD11b和CD14的表达。 4.ERK信号通路在ATPR诱导K562细胞分化中的作用 为了验证ERK信号通路在ATPR诱导分化中是否起关键作用，用PD98059预处理K562细胞24h，再使用ATPR(10-6 M)处理细胞72h，使用western blot技术对于细胞中eIF3a、cyclin D1、c-myc、p-Raf-1和p-ERK蛋白表达量进行检测；使用瑞氏吉姆萨染色检测细胞的形态学变化；使用流式细胞仪检测细髓系分化抗原CD11b和CD14的表达量变化。结果显示：PD98059降低了ERK的活化以及促进量cyclin D1和c-myc的表达量升高，但p-Raf-1和eIF3a在其预处理后没有明显变化；PD98059可以影响K562细胞的形态学变化，阻滞细胞分化成熟。