【摘 要】
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目的: 筛选出与CVB33C蛋白发生相互作用的人心脏细胞蛋白,并对阳性cDNA克隆进行分析和鉴定,为进一步探讨CVB3的致病机制奠定基础。 方法: 1、构建pGBKT7-3C诱饵质粒
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目的: 筛选出与CVB33C蛋白发生相互作用的人心脏细胞蛋白,并对阳性cDNA克隆进行分析和鉴定,为进一步探讨CVB3的致病机制奠定基础。 方法: 1、构建pGBKT7-3C诱饵质粒:提取CVB3感染的HeLa细胞的总mRNA,逆转录为cDNA,PCR扩增3C基因片段,用EcoR I和BamH I双酶切后,克隆于载体pGBKT7中,酶切鉴定进行DNA测序验证; 2、检测诱饵质粒pGBKT7-3C在AH109酵母菌中表达与对报告基因的自激活:验证AH109表型,将诱饵质粒pGBKT7-3C用乙酸锂法转化至AH109中,挑取含pGBKT7-3C重组质粒的阳性克隆接种选择性培养平板,进行表型的鉴定,PCR验证阳性酵母菌,Western Blot方法检测融合蛋白表达,最后检测DNA-BD-c-Myc-3C融合蛋白对报告基因的转录自激活; 3、从人心脏cDNA文库中筛选与CVB3-3C蛋白有相互作用的阳性候选克隆:采用大规模酵母配合法,将诱饵菌AH109[pGBKT7-3C]和人心脏cDNA文库的培养物Y187[pGADT7-cDNA Library]相互配合,配合后接种于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板,30℃倒置培养21d,筛选表达报告基因HIS3和ADE2的克隆; 4、阳性克隆的验证和分析:将阳性克隆再转种于SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal平板,确保阳性克隆表型正确(能同时表达3种报告基因:HIS3、ADE2和MEL1);将pGADT7-ADx质粒电击转化至大肠杆菌,扩增后提取质粒送测序。测序结果的同源性分析通过NCBI网站的BLAST程序比对完成(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)。 结果: 1、成功构建pGBKT7-3C诱饵质粒,经限制性内切酶酶切和测序序列分析表明3C巳成功插入pGBKT7载体的多克隆位点,其基因序列与CVB3m株(GI:323432)3C基因序列完全一致; 2、表型鉴定和PCR法均证实pGBKT7-3C质粒成功转入酵母菌,Western blot证实AHl09能表达3C蛋白;缺陷型培养基和酶底物X-α-Gal反应结果显示3C蛋白对报告基因无转录自激活作用; 3、以CVB33C为诱饵蛋白,从人心脏cDNA文库中筛选到18个阳性候选克隆; 4、18个阳性候选克隆表型均正确(能同时表达3种报告基因:HIS3、ADE2和MEL1);经测序和同源性比对,共获得2种不同类别的阳性蛋白:心肌肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)和肌间蛋白3(MYOM3); 结论: 1、成功构建pGBKT7-3C诱饵质粒; 2、成功从人心脏cDNA文库中获得2种不同阳性蛋白:心肌肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)和肌间蛋白3(MYOM3),为研究CVB3引起心肌炎和心肌病的分子致病机制提供了新方向。
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