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目的:将增强绿色荧光蛋白基因egfp克隆入防龋DNA疫苗pVAX1-SA中,使egfp与pVAX1-SA中表达变异链球菌表面蛋白A区的目的基因spap/A通过一段连接肽连接而形成融合基因,构建egfp为标记基因的防龋DNA疫苗pVAX1-SA-EGFP,并将此重组质粒通过脂质体转染真核细胞HepG-2,观察绿色荧光蛋白的表达,同时通过免疫组化法检测目的蛋白的表达。egfp为报告基因的防龋DNA疫苗pVAX1-SA-EGFP的成功构建,为防龋疫苗pVAX1-SA的机制研究奠定一定基础。 方法:本实验包括两部分: 第一部分:可示踪防龋DNA疫苗pVAX1-SA-EGFP的构建 以质粒 pIRES2-EGFP为模板,利用egfp编码区设计一对引物,PCR扩增egfp编码区序列,克隆入pGEM-T载体中,经菌液PCR,NheⅠ、HindⅢ双酶切及测序验证正确后,克隆入 pVAX1-SA中,将质粒转入感受态细胞,挑取转化子,利用菌液PCR,NheⅠ、HindⅢ双酶切及测序验证重组子。设计15个脯氨酸聚合肽作为目的蛋白和EGFP的连接肽,连接肽碱基序列两端设计HindⅢ、KpnⅠ两种酶切位点,连接肽双酶切后在连接酶的作用下连接入经 HindⅢ、KpnⅠ限制性内切酶双酶切后的载体中,菌液PCR,酶切及测序验证重组子。 第二部分:质粒pVAX1-SA-EGFP在真核细胞HepG-2的表达 将质粒pVAX1-SA-EGFP通过脂质体转染至肝癌细胞HepG-2,荧光显微镜检测绿色荧光是否表达,SABC法检测重组质粒pVAX1-SA-EGFP是否在真核细胞中表达目的蛋白。 结果:PCR扩增出约720bp大小的片段,与预期的 egfp长度相符,重组质粒经HindⅢ、KpnⅠ双酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳可见两条大小约为3.3kb和720bp大小的条带,与预期结果一致,测序结果表明 egfp及连接肽基因片段成功插入对应位点。重组质粒在转染肝癌细胞HepG-2后,可观察到绿色荧光蛋白的表达,免疫组化检测到目的蛋白的表达。 结论:成功构建了egfp为报告基因的防龋DNA疫苗pVAX1-SA-EGFP,该质粒转染真核细胞 HepG-2后,能够表达增强绿色荧光蛋白和目的蛋白。pVAX1-SA-EGFP的成功构建,为本课题组后期防龋DNA疫苗的机制研究奠定一定的基础。