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PTPN12基因最初克隆于1992年,其编码的PTPN12蛋白是非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶亚家族的成员之一,主要表达于细胞质中。PTPN12全长共780个氨基酸残基,分子量为112kD,包括位于N端的催化结构域和位于C端的PEST结构域,广泛表达于多种组织和细胞中,特别是在造血系统中表达量比较高。PTPN12在胚胎发育早期开始表达,并且在胚胎发育过程中发挥必不可少的作用。敲除PTPN12基因,小鼠可以形成正常的原肠胚和卵黄囊,但是后续发育缺陷导致小鼠在胚胎发育早期死亡。磷酸酶PTPN12底物众多,酶活力较强,通过去磷酸化多种底物而在细胞迁移、细胞增殖、免疫应答、胚胎发育、破骨细胞分化等多种生理过程中发挥非常关键的作用。最近的研究表明,PTPN12是三阴性乳腺癌的抑制因子。在二阴性乳腺癌患者体内PTPN12往往低表达或者存在失活突变,丧失了对EGFR、HER2和PDGFR等底物的去磷酸化能力,导致EGFR、HER2和PDGFR等多条原癌通路激活,进而导致恶性肿瘤的发生和发展。条件性敲除小鼠乳腺上皮细胞中的PTPN12基因,会加速乳腺癌的恶性发展以及乳腺癌的肺转移。虽然已有大量的研究表明PTPN12通过调控底物的磷酸化在多种生理过程中发挥非常重要的作用,但是其底物特异性以及分子机制还十分不清楚。本文通过悬滴法结晶获得了PTPN12催化结构域K61R突变体的蛋白质晶体,经解析获得分辨率为2.4埃的PTPN12催化结构域的晶体结构。通过结构生物学和酶学研究,阐明了 PTPN12的底物特异性,并且揭示了决定PTPN12底物特异性的两个结构特征:pY+1位置的结合口袋和位于蛋白表面的碱性氨基酸残基。PTPN12结构的可塑性区域以及位于表面的关键氨基酸残基对于PTPN12识别HER2的不同磷酸化位点非常重要。我们进一步结合细胞学研究,阐明了PTPN12底物特异性对细胞功能的影响。除此之外,通过对晶体结构的研究和体外磷酸化实验,本文发现在PTPN12催化结构域存在一个可以被CDK2磷酸化的位点S19。综上所述,我们的研究结果不仅揭示了 PTPN12去磷酸化底物的工作原理以及对乳腺癌细胞功能的影响,同时也为设计PTPN12的特异性抑制剂提供了坚实的理论基础。研究目的通过酶学、结构生物学和细胞学研究,解析PTPN12催化结构域的晶体结构,阐明PTPN12的底物特异性以及分子机制,探究PTPN12底物特异性对乳腺癌细胞功能的影响。研究方法1)质粒构建将PTPN12催化结构域(1-305)克隆到pET-15b原核表达载体上,N端His标签,通过Quick Change的方法构建PTPN12点突变质粒。将PTPN12催化结构域和全长分别克隆到pcDNA3.1真核表达载体上,C端Flag标签。将CDK2全长克隆到PGEX-6P-2原核表达载体上,N端GST标签。2)蛋白表达与纯化将His标签PTPN12催化结构域野生型和突变体的质粒分别转染进大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG低温诱导表达蛋白,分别经Ni-beads和分子筛纯化使蛋白纯度高于95%,经超滤浓缩获得浓度为8-10mg/ml的蛋白。His标签BDP1和Lyp磷酸酶催化结构域的蛋白表达和His-PTPN 12催化结构域的蛋白表达、纯化方法相同。将GST标签的CDK2全长质粒转染进大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG低温诱导表达蛋白,GST-beads纯化获得纯度高于90%的蛋白,经超滤浓缩使蛋白浓度为8-1 0mg/ml。3)蛋白结晶及结构解析使用纯度高于95%,浓度为8-10mg/ml的PTPN12催化结构域野生型蛋白和K61R突变体蛋白,分别通过悬滴法结晶并静置于4℃培养箱中。虽然野生型蛋白结晶没有成功,但是三个月后获得了 His-PTPN12催化结构域K61R突变体的蛋白质单晶,通过X射线衍射收集数据,经分子置换以及软件优化获得了分辨率为2.4埃的PTPN12催化结构域三维结构。4)酶活力检测使用96孔酶标板,采用终点读数法分别检测PTPN12、BDP1和Lyp对小分子底物pNPP、DiFMUP和OMFP的酶活力,使用GraphPad Prism5软件拟合米氏方程并且计算出酶活常数Km和Kcat。使用96孔酶标板,通过无机定磷法检测PTPN12野生型和突变体蛋白对于多种磷酸化酪氨酸短肽的酶活力,使用GraphPad Prism5软件拟合米氏方程并且计算出酶活常数Km和Kcat。5)免疫共沉淀在HEK-293细胞中共转染CDK2质粒和PTPN12质粒,经免疫共沉淀,检测CDK2对PTPN 1 2的磷酸化作用。在HEK-293细胞中共转染CDK2质粒和PTPN12-S19A突变体质粒,确定出S19是CDK2磷酸化PTPN12的主要位点。6)细胞功能检测在MDA-MB-231乳腺癌细胞中分别过表达PTPN12野生型以及不同突变体的质粒,给予EGF刺激之后,通过MTT比色法检测活细胞的数量,从而检测PTPN12野生型以及不同突变体对于MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖能力的影响。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中分别过表达PTPN12野生型以及不同突变体的质粒,在transwell上室中使用无血清培养基培养已转染的乳腺癌细胞,在下室中加入含EGF的完全培养基诱导细胞从上室向下室迁移,通过结晶紫染色并计数迁移的细胞数目,检测PTPN12野生型以及不同突变体对于乳腺癌细胞迁移能力的影响。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中分别共转染Ub和PTPN12野生型以及不同突变体催化结构域的质粒,通过免疫共沉淀的方法检测PTPN12野生型及不同突变体对HER2泛素化的影响。7)体外磷酸化实验构建25μl反应体系,在MOPS缓冲溶液中37℃共孵育GST-CDK2蛋白、cyclinA蛋白、His-PTPN12催化结构域蛋白和ATP,磷酸化反应以最后加入CDK2蛋白为起始,以加入loading buffer为反应终止。通过Western Blotting,使用CDKS-substrate antibody 检测 PTPN12 的磷酸化。研究结果1)解析了抑癌基因PTPN12催化结构域的晶体结构2)阐明了 PTPN12的底物特异性以及分子机制3)探究了 PTPN12底物特异性对乳腺癌细胞功能的影响4)证实了 PTPN12是CDK2的底物