背景与目的肾癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾小管上皮细胞的一种常见肾脏恶性肿瘤,占成人全部恶性肿瘤的2%-3%,占肾脏原发恶性肿瘤的85%-90%。肾癌组织分型较多,主要有透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌和未分类肾细胞癌,其中以肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)最常见,约占肾癌70～80%。因其起病隐匿,不易早期诊断,死亡率高。目前除早期施行外科手术治疗外,尚无其它有效治疗措施。肾透明细胞癌同其它类型的肾癌一样,对放化疗及激素治疗均不敏感。近年来晚期肾癌的生物靶向治疗虽然取得一定进展,但疗效仍很有限。据统计约1/3的局限性肾癌术后可能出现转移或复发,进展期肾癌的5年生存率低于10%。肿瘤复发、转移仍是威胁患者生命的主要因素,因此肾癌的早期诊断及晚期肾癌的有效治疗是目前医学工作者研究的重点。目前研究显示微小RNA(microRNA, miRNA)有可能会成为一种肾癌的早期诊断标志物和晚期治疗的新靶点。肾癌的发病机制研究目前主要从基因组学、蛋白组学和microRNA组学等几方面展开。其中miRNA是近年来发现的一种广泛存在于多细胞生物中的微小RNA,长度为20-22个核苷酸,其本身不编码蛋白质,而是通过与靶基因的非翻译区(3’UTR)结合,引导沉默复合体(RISC),使靶基因mRNA降解或抑制蛋白质翻译,miRNA作为转录后水平上的调控因子,在个体的生长发育和细胞的增殖、分化等多种生物学过程中发挥重要作用。越来越多的证据表明miRNA与肿瘤的发生有密切的关系,通过其下游靶基因的介导,参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭或肿瘤血管形成等过程,起着抑癌基因或癌基因的生物学作用。miRNA与体内基因存在着复杂的联系,具体表现为一个miRNA可以有多个靶基因,而一个靶基因也可能受多个miRNA调控。近年发现50%以上的miRNA定位于已经被证明在肿瘤中会发生改变的染色体区域,包括最小杂合子缺失区域(minimal regions of LOH),通常有抑癌基因定位其中；最小扩增区域(minimal regions of amplification),其中可能包含癌基因。在一些疾病中miRNA的表达谱改变具有明显的特征,尤其是在肿瘤疾病中,正常癌旁组织和肿瘤组织中microRNA表达谱具有明显差异。人们发现对不同肿瘤特定的miRNA水平进行分析,有助于肿瘤的早期诊断,有望发现能成为多种恶性肿瘤诊断和转移预后的分子标志。初步的结果显示肾癌组织与癌旁正常肾组织的miRNA表达谱有特征性改变,但国内外相关文献甚少。本研究旨在使用高通量、高灵敏度和高特异性的miRNA芯片(Exiqon公司)研究肾透明细胞癌(ccRCC)组织与癌旁正常肾组织的miRNA表达谱,筛选出特异表达的miRNA,采用实时定量PCR检测验证。机体内的miRNA和基因之间存在着复杂的调控网络,具体表现在一个miRNA可以有多个靶基因,而一个基因也可以与多个miRNA结合。为更好地分析肾透明细胞癌基因表达谱与miRNA表达谱的关系,我们结合几年前我们采用Agilent芯片完成的4例肾透明细胞癌基因表达谱,应用miRNA靶基因预测软件：TargetScan, miRanda和PietTar,对上述实验筛选出来的差异表达的miRNA基因进行预测,找出miRNA与靶基因3’UTR区域可能的作用靶点,分析差异表达miRNA与靶基因之间的联系,为进一步研究miRNA在肾肿瘤发生发展过程中的作用打下基础。miR-3133在肾透明细胞癌组织中明显下调。在肾癌的生物学过程中,可能扮演着抑癌基因的作用。miR-3133为新近增加的一个基因,目前国际国内均无相关文献报道,尚很难确定其靶基因和作用调控机理,为对其功能展开深入研究,我们人工合成其序列,将其转染至人肾癌786-0细胞株,RT-PCR和Western Blot检测沉默miRNA基因后效果；同时行划痕试验了解其迁移力,行Transwell检测其侵袭力,以及通过流式细胞仪和MTT试验了解癌细胞株增殖及凋亡情况。研究目的：1、应用Exiqon公司的miRCURYTM LNA miRNA芯片,检测cc-RCC的microRNA(miRNA)的差异表达谱,筛选出差异表达的miRNA基因；实时定量PCR验证实验结果,以期建立起可靠的cc-RCC的miRNA表达谱。2、利用miRNA靶基因预测软件,分析肾透明细胞癌的miRNA表达谱和基因表达谱,旨在发现差异表达miRNA的靶基因,揭示miRNA与靶mRNA的调控关系,为深入探讨cc-RCC发病机制提供相关依据。3、人工合成miR-3133的序列,将其转染至肾癌786-0细胞株,通过一系列体外细胞生物学实验,观察miR-3133表达或抑制对肾癌786-0细胞株生物性状的影响,进一步证实miRNA在cc-RCC的发生发展过程中的重要作用。材料和方法一、肾透明细胞癌miRNA表达谱的建立与筛选选取8例于2009年6月-2010年9月在南方医院泌尿外科住院的cc-RCC患者。8例均于肾癌根治术后0.5h内分别取肿瘤组织和癌旁组织(距癌组织大于2 cm)置于液氮罐冻存备用。所有标本均经常规病理检查证实。标本按照一步法抽提其中的总RNA,经质检合格后,分离出miRNA并标记,制成杂交液与miRNA芯片杂交,再经洗片、扫描及数据分析处理,获得差异表达miRNA基因。再经实时荧光定量PCR验证结果,获得肾透明细胞癌miRNA表达谱,分析差异表达miRNA可能的临床意义及靶基因,同时对新发现的miRNA进行归类初步研究。二、肾透明细胞癌差异表达miRNA的靶基因预测根据以上miRNA表达谱和几年前我们采用Agilent芯片完成的基因表达谱,运用生物信息学方法,综合分析mRNA和miRNA表达谱,揭示miRNA和]mRNA之间的相互作用调控关系。采用三种miRNA靶基因预测软件,对差异表达的miRNA基因进行预测,找出miRNA与靶基因3’UTR区域可能的作用靶点,分析差异表达miRNA与靶mRNA之间的复杂关系。三、人工合成miR-3133的序列,将其转染至肾癌786-0细胞株,通过一系列体外细胞生物学实验,观察miR-3133表达或抑制对肾癌786-0细胞株生物性状的影响。1. miR-3133/anti-miR-3133的转染及qRT-PCR的检测：①实验分四组：未转染组(Mock)、阴性序列转染组(NC)、miR-3133 mimic转染组、miR-3133 inhibitor转染组；②细胞培养及转染：将786-0细胞以每孔约1×106个细胞接种于6孔培养板中,在37℃、5%C02及饱和湿度条件下转染各质粒—lipofectamine2000复合物至对应细胞。③运用qRT-PCR检测转染后48小时各组miR-3133的表达量；用相对定量数据分析：以2-△△Ct(Ct代表循环阈值)表示基因的表达量,平均相对含量＝2-averge△△ACT×100%,干扰效率=(1-2-average△△CT)×100%,公式：ΔΔCt={Ct(ezrin)-Ct(β-actin)}干扰细胞—{Ct (ezrin)-Ct (β-actin)}对照(未转染细胞)。2.MTT检测细胞增殖活性：分别于转染后12h、24h、36h及72h收集各组细胞,每组3孔；在酶联免疫检测仪上测定各孔的光密度值(OD值),比较各组细胞的增殖情况。3.划痕和拍照：转染成功后每组6个复孔,分别培养于12孔板中,当细胞生长到融合度为95%时,以1mL枪头垂直作划痕试验,24小时后计算各组迁移到划痕区域的细胞数,并拍照计算划痕区面积。4.体外Transwell侵袭力实验：各组细胞在无血清RPMI-1640培养基中培养过夜,各组细胞在Transwell板上各取3个复孔,下室中加入完整培养基500pL,上室中加入含有1×106个细胞的无血清培养基200μL,24小时后用棉签去掉隔膜上表面的细胞和胶,然后固定、复染,在400倍显微镜下选5个不同视野计数隔膜下表面的细胞,计算细胞侵袭力。结果一、肾透明细胞癌肾miRNA表达谱的建立与筛选1、8例癌组织和4例癌旁组织的总RNA抽提和质检,结果理想,总RNA的A260/A280的值都介于1.8-2.1之间,总RNA的电泳带18s和28s均清晰,表明核酸成份完整,无降解及污染。2、芯片样品杂交信号相关性散点图显示肿瘤与对照组间样品的杂交信号相关性较低,体现了实验组和对照组样品间生物学性质差异较大。3、肾透明细胞癌组织与癌旁组织中存在差异表达的miRNA,其中上调miRNA基因106个,下调miRNA基因184个,有111个新增的miRNA;而通过t检验上调的miRNA仅3个,下调的miRNA 38个,下调的miRNA多于上调的。4. qRT—PCR检测验证显示癌组织中miR-142-5p和miR-375的表达高于癌旁组织,而miR-3133、miR-3907(?)和miR-1236的表达低于癌旁组织,与芯片结果一致。二、肾透明细胞癌差异表达miRNA的靶基因预测采用生物信息计算方法,发现30个肾透明细胞癌组织中差异表达的基因,近一半肿瘤相关基因受miRNA的调控,其中SEMA3A、BTG2和HIF1A基因分别受10个以上的miRNA家族调控。另外,通过分析发现基因与miRNA之间调控存在反相关性,即调控基因组上调基因的miRNA大部分出现在miRNA表达谱的下调序列中。三、miR-3133对人肾癌786-0细胞株生物学性状影响的研究1.转染效率测定：于转染48h后检测各组miR-3133的表达量。2.MTT法检测结果表明：单因素方差分析,结果显示组别间差异有显著性(F=11.835,P<0.05),不同时间水平间差异有统计学意义(F=11.573,P<0.000),组别与时间之间有交互作用(F=79.245,P<0.000)。进一步分析单独效应,结果显示在固定组别条件下,各时间点差异有统计学意义(P均P<0.001),在固定时间因素条件下,从24h后开始各组间差异有统计学意义(P均P<0.01),提示miR-3133被抑制后,786-0细胞增殖能力有所增强。3.迁移力实验表明：划痕24和36小时后观察各组划痕面积大小,对比发现36小时后miR-3133 inhibitor组细胞完全融合；而miR-3133 mimic组划痕面积仍最大。说明抑制miR-3133后人肾癌786-0细胞迁移能力增强。4.侵袭实验结果显示,侵过基质胶膜的细胞均数为：786-0组为43±8/HP；miR-3133 mimic组为17±4/HP; miR-3133 inhibitor组为108±13/HP；阴性对照组40±7/HP。单因素方差分析发现,miR-3133 inhibitor组侵过基质胶膜细胞数多于其他三组,且有统计学意义(P<0 05)。结论1、肾透明细胞癌的miRNA表达谱有组织特异性；在肾透明细胞癌组织中上调miRNA基因106个,下调miRNA基因184个；其中通过t检验上调的miRNA有3个,下调的miRNA38个。发现16.0版新增的差异表达miRNA111个。2、进一步验证了miR-155、miR-210、miR-141、miR-16、miR-200c及let-7家族等miRNAs与肾透明细胞癌的发病机制密切相关,其在疾病进程中发挥着重要作用。3、生物信息学方法可综合分析基因组表达谱和miRNA表达谱的作用关系,建立基因和miRNA的作用调控关系,能较好地预测出miRNA的靶基因。通过分析发现基因与miRNA之间调控存在反相关性,即调控基因组上调基因的miRNA大部分出现在miRNA表达谱的下调序列中。4、miR-3133在肾透明细胞癌组织中显著低表达。体外实验,调高其在肾癌786-0细胞中的表达后,发现786-0细胞生物活性降低；而抑制其在786-0细胞中的表达后,其活性增强。提示miR-3133在肾透明细胞癌的生物学过程中可能扮演着抑癌基因的角色。