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结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,虽然临床治疗技术的进步提高了疗效,但患者死亡率依然很高。深入研究CRC发生发展机制,寻求新的治疗靶点仍然是重要任务。肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多向分化和无限增殖等干细胞特性的细胞群体。基础和临床研究证实了CSC在CRC发生发展中的作用。髓源性抑制细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）是骨髓来源的具有免疫抑制能力的异质性细胞群体,其在感染、炎症及恶性肿瘤等病理状态下大量存在。MDSC通过抑制机体抗肿瘤免疫应答、维持肿瘤细胞干性及促进血管形成等多种方式参与肿瘤发生发展。Exosomes（Exo）是直径为30-150 nm的囊泡,携带来源细胞的蛋白质和核酸,在细胞间信息传递中发挥重要作用,参与肿瘤发展的多个环节。目的:本研究探讨粒细胞样MDSC（Granulocytic MDSC,G-MDSC）分泌的 exosomes（GM-Exo）与CRC细胞干性之间的关系,寻找GM-Exo调控CRC细胞干性的关键成分;了解缺氧对G-MDSC分泌exosomes的作用。在此基础上,评估GM-Exo的关键成分在CRC的临床应用价值。方法:1.G-MDSC可通过exosomes促进结直肠癌细胞的干性利用CT-26细胞构建荷瘤小鼠模型,免疫磁珠法分选脾脏G-MDSC,流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）分析纯度。收集G-MDSC培养上清,利用超速离心联合exosomes分离试剂盒制备GM-Exo,通过透射电镜进行形态学观察,Western blot检测表面分子,BCA微量蛋白检测法测定蛋白浓度。Rab27a是决定细胞分泌exosomes的关键蛋白,利用siRNA抑制G-MDSC中Rab27a表达,故而抑制GM-Exo分泌;体内过继转移G-MDSC至荷瘤小鼠,观察肿瘤生长的影响。体外GM-Exo处理CT-26细胞,利用成球试验检测CT-26细胞的成球能力,利用FCM检测CD133/CD44阳性CT-26细胞百分比,利用荷瘤小鼠模型观察GM-Exo对CT-26细胞生长的作用。2.探讨GM-Exo中参与CT-26细胞干性调控的主要成分利用siRNA抑制G-MDSC中S100A9表达以降低GM-Exo中S100A9含量(定义为GM-ExoS100A9KD)。GM-Exo或者GM-ExoS100A9KD处理CT-26细胞,利用成球试验检测CT-26细胞成球能力,FCM术分析CD133/CD44阳性细胞的百分比;利用Western blot检测CT-26细胞中Sox2/Oct4/Nanog/ALDHA1、Nox4、p-Stat3和p-P65表达量;FCM分析ROS的量;克隆形成试验检测细胞增殖能力,迁移实验和肝转移模型观察CT-26细胞迁移能力。利用AOM/DSS诱导结肠炎相关癌（Colitis-associated cancer,CAC）小鼠模型,尾静脉注射PKH-26标记的GM-Exo,免疫荧光技术和FCM观察GM-Exo在结直肠组织中分布情况。GM-Exo和GM-ExoS100A9KD处理CAC后,监测各组小鼠体重,观察结直肠外观,H（5）E染色观察小鼠肿瘤浸润情况,免疫荧光技术检测结直肠组织exosomes的分布及CD133表达情况,FCM检测小鼠体内G-MDSC比例及T细胞亚群比例变化情况。3.缺氧对G-MDSC分泌exosomes的影响免疫磁珠法分离CAC小鼠肿瘤局部和脾脏G-MDSC,qRT-PCR检测HIF-1?和HIF-2?表达量;体外培养G-MDSC,ExoELISA方法测定GM-Exo;体外缺氧/常氧条件下培养脾脏G-MDSC后收集上清,ExoELISA方法测定GM-Exo。缺氧诱导因子抑制剂YC-1抑制G-MDSC中HIF-1?,体外缺氧/常氧条件下培养,ExoELISA方法测定GM-Exo,Western blot检测Rab27a水平。4.评估血浆exosomal S100A9在CRC的临床应用价值收集不同类型结直肠癌患者和健康对照者外周血血浆,分离制备exosomes。FCM分选CD11b+或者CD11b-exosomes,ELISA检测exosomes中S100A9水平;ELISA检测患者血浆exosomes中S100A9的水平。流式细胞技术分选CRC患者肿瘤组织MDSC,制备MDSC来源exosomes（M-Exo）;利用si RNA抑制MDSC中S100A9,制备包含S100A9较少的M-Exo(M-ExoS100A9KD);分别用其处理人源性结肠癌细胞SW480,成球试验观察SW480的成球能力;用不同处理后的SW480细胞构建荷瘤小鼠,观察肿瘤发生率和肿瘤生长情况。结果:1.Rab27a si RNA处理的G-MDSC分泌exosomes明显减少（P＜0.01）。分泌exosomes能力减弱后G-MDSC促进CT-26细胞成球能力减弱,促进CD133/CD44表达的能力下降（P＜0.01）,促肿瘤生长能力减弱（P＜0.05）。CT-26细胞可摄取GM-Exo,构建荷瘤小鼠模型后,肿瘤生长较快。2.G-MDSC及其exosomes均高表达S100A9。较GM-Exo,GM-Exo S100A9KD中S100A9含量降低。S100A9抑制后GM-Exo促进CT-26细胞成球能力下降（P＜0.01）,促进CD133/CD44表达的能力下降（P＜0.01）,增加CT-26细胞Sox2/Oct4/Nanog/ALDHA1、Nox4、p-Stat3、p-P65和ROS表达的能力减弱,促肿瘤生长（P＜0.01）和迁移的能力减弱（P＜0.05）。在尾静脉注射情况下,外源性GM-Exo分布至CAC小鼠结直肠局部。较PBS或GM-Exo S100A9KD处理的CAC小鼠,GM-Exo处理组小鼠体重增长缓慢,结肠缩短显著（P＜0.05）,肿瘤结节增多（P＜0.01）,肿瘤浸润程度加重,组织中CD133增多,CD133阳性细胞的百分比增加（P＜0.01）,外周血及肿瘤局部G-MDSC均增加（P＜0.01或P＜0.05）,CD4+T细胞（P＜0.05）和CD8+T细胞（P＜0.05）减少。3.肿瘤局部G-MDSC exosome分泌量明显高于脾脏G-MDSC（P＜0.01）。肿瘤局部G-MDSC中HIF-1?m RNA水平高于脾脏G-MDSC（P＜0.01）。缺氧条件下,脾脏G-MDSC培养上清中exosomes的量较常氧下增多（P＜0.01）,并且HIF-1?和Rab27a水平增加。缺氧条件下,脾脏G-MDSC经HIF-1?抑制剂YC-1处理后exosomes分泌量较未处理组明显减少（P＜0.01）,并且Rab27a水平下降。4.人血浆中CD11b+exosomes约占exosomes总量的10%,CD11b+exosomes中S100A9的含量显著高于CD11b-exosomes。CRC患者血浆exosomal S100A9水平高于健康对照（P＜0.001）,并且术后复发的CRC患者血浆exosomal S100A9水平高于术后无复发患者（P＜0.001）。较PBS处理组,M-Exo处理的SW480的成球能力增强（P＜0.01）,生长较快;S100A9抑制的M-Exo的促SW480的成球能力下降,生长缓慢（P＜0.01）。结论:G-MDSC通过exosomal S100A9增强结直肠癌细胞干性,缺氧环境是促进G-MDSC分泌exosomes的重要因素。人血浆exosomal S100A9的变化可为CRC的复发提供临床依据。