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(1)铁死亡在NEC患儿肠上皮细胞中的发现背景:研究表明多种类型的调节性细胞死亡（Regulated cell death,RCD）能导致肠道屏障功能障碍,是新生儿坏死性小肠结肠炎（Necrotizing Enterocolitis,NEC）的发病原因之一。铁死亡是最近发现的一种RCD,其是否存在于NEC病变肠组织中并发挥作用尚无相关报道。方法:本研究收集了来自GEO数据库GSE46619数据集中的8例新生儿肠组织微阵列检测数据,其中包括NEC患儿4例和正常对照患儿4例。基于R包Limma差异表达基因分析用于鉴定NEC组织中的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,主成分分析（Principle component analysis,PCA）和热图分析用于探索铁死亡在NEC组和对照组的表达差异,基于R包GSVA的单样本基因集富集分析（Singlesample Gene Set Enrichment Analysis,ss GSEA）用于量化铁死亡在每个肠组织的相对水平。实验室研究通过亚铁嗪法检测NEC患儿肠组织铁浓度;脂质过氧化产物戊二醛（MDA）评估脂质过氧化水平;透射电镜观察铁死亡细胞形态改变;最后,采用免疫组织化学方法检测铁死亡信号通路中的关键基因蛋白表达水平。结果:对GSE46619数据集中肠组织微阵列数据的差异表达分析发现,NEC组肠组织和对照组肠组织间存在1571个DEGs,其中有铁死亡相关的基因35个。PCA分析和热图分析均提示铁死亡相关基因在NEC组肠组织中明显富集。对ss GSEA分析得到的铁死亡评分进行统计分析发现,NEC组的铁死亡水平显著高于对照组的铁死亡水平（t检验;P=0.002921）。进一步的实验室研究发现NEC患儿肠组织铁累积、脂质过氧化损伤、电镜下典型铁死亡形态改变及铁死亡信号通路关键基因表达改变。NEC患儿肠组织铁浓度增加（t检验,P=0.0155）、脂质过氧化MDA水平升高（t检验,P=0.003）;铁死亡信号通路中的关键基因GPX4、ACSL4、FTH1表达水平改变且与铁死亡发生时改变一致;肠上皮细胞电镜下见线粒体固缩、线粒体外膜增厚、线粒体嵴消失等典型铁死亡亚细胞形态改变。结论:在NEC患儿的病变肠组织中存在铁死亡现象,是NEC发生发展的潜在机制之一。本研究结果将为进一步探索铁死亡在NEC的发病机制研究提供理论依据。（2）多种类型的调节性细胞死亡、炎症及缺氧共同参与NEC发生背景:目前关于RCDs、炎症及缺氧在NEC发生机制中的研究多数为动物或细胞模型水平研究,缺乏人源标本的更直接的研究结论;基于此,本研究旨在明确人源的肠组织中RCDs、炎症及缺氧是否存在于NEC肠道损伤。方法:研究收集了来自GEO数据库GSE46619数据集中的8例新生儿肠组织微阵列测序数据,其中NEC患儿4例和正常对照患儿4例。基于R包Limma的差异表达基因分析用于鉴定NEC组织中的DEGs。基于R包GSVA的单样本基因集富集分析ss GSEA用于量化细胞凋亡、细胞焦亡、细胞自噬、炎症和缺氧等现象相关基因在每个小肠组织的相对水平。在线功能注释网站（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID）用于对DEGs进行功能注释。本地软件GSEA基于所有基因的表达值对不同组富集的信号通路进行分析。结果:生物信息学分析对GSE46619数据集中质量合格的4个NEC肠组织和4个正常肠组织测序结果进行统计分析,结果发现在NEC肠组织中细胞自噬（t检验;P=0.0002065）和凋亡（t检验;P=0.01583）的水平均显著上调,焦亡（t检验;P=0.06）水平有升高趋势,炎症水平（t检验;P=0.0009731）和缺氧水平也显著升高（t检验;P=0.003936）。铁死亡信号通路中关键基因ACSL4与NEC发生中凋亡（R=0.95,P=0.00028）、自噬（R=0.97,P=0.000079）和焦亡（R=0.81,P=0.015）、缺氧（R=0.96,P=0.000011）和炎症（R=0.96,P=0.0004）均显著相关。在NEC肠组织中有多个炎症相关信号通路富集,包括Nod样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和Toll样受体信号通路等。此外,巨噬细胞、活化的树突状细胞、中性粒细胞等多种免疫细胞激活相关基因与ACSL4的表达水平升高也显著有关。结论:在新生儿NEC肠组织中细胞凋亡、焦亡、自噬、炎症及缺氧的水平升高,多个与炎症损伤相关的炎症分子表达水平也显著升高。ACSL4表达水平与多个类型的RCDs、缺氧及炎症相关,是NEC潜在的治疗靶点。（3）铁死亡现象在两种NEC动物模型中的验证目的:探索经典NEC动物模型和输血相关NEC动物模型中是否存在铁死亡现象。方法:研究采用C57BL/6新生小鼠,通过“低氧-低温-LPS”及“贫血-输血”两种方法建立经典NEC动物模型和输血相关NEC动物模型。检测NEC小鼠肠组织铁浓度、脂质过氧化水平、肠上皮细胞透射电镜下肠上皮细胞典型的铁死亡形态表现以及部分铁死亡信号通路中关键基因的表达水平等方法,以明确NEC小鼠的病变肠组织是否存在铁死亡。结果:在经典NEC动物模型中,小鼠肠上皮细胞铁累积（t检验,P=0.0003）、脂质过氧化产物增加（t检验,P=0.0010）;类似的,在输血相关NEC动物模型中也发现铁累积（t检验,P＜0.0001）、脂质过氧化产物增加（t检验,P＜0.0001）。两种模型小鼠的肠上皮细胞均发现线粒体固缩、线粒体嵴消失等典型铁死亡细胞形态改变;部分铁死亡信号通路的关键基因表达水平在动物模型中也有表达改变。结论:在经典NEC动物模型和输血相关NEC动物模型中均发现铁死亡现象,表现为铁累积、脂质过氧化损伤及铁死亡细胞典型的线粒体形态改变,与人源标本的结果一致;两种NEC小鼠模型均可作为开展NEC铁死亡相关发病机制体内研究的研究对象。（4）血红素在输血相关NEC肠上皮细胞铁死亡发生中的作用背景:输血相关NEC动物模型中存在铁死亡现象,但其具体机制仍不清楚。输血相关NEC肠组织铁累积、病变肠组织可见大量红细胞浸润,且红细胞在炎症状态下溶血释放血红素。基于铁死亡是一种铁依赖的RCD,破碎红细胞释放的血红素将为细胞提供大量亚铁离子。血红素是否参与NEC肠上皮细胞铁累积,进而导致铁死亡发生尚无相关报道。方法:研究以类似于正常分化小肠上皮细胞的人结肠癌细胞系Caco-2细胞作为研究对象,将其与不同浓度的血红素、铁死亡抑制剂liproxstatin-1（Lip-1）共同培养。检测不同条件下Caco-2细胞铁浓度、脂质过氧化产物MDA水平、线粒体活性氧簇（ROS）水平、线粒体膜电位（JC-1）、铁死亡信号通路关键基因的蛋白表达水平,并观察透射电镜下Caco-2细胞的亚细胞结构。结果:将血红素与Caco-2细胞共同培养,结果发现随着血红素浓度增加,细胞活性降低（单因素方差分析,P＜0.0001）;细胞铁浓度逐渐增加（单因素方差分析,P＜0.0001）、脂质过氧化产物MDA（单因素方差分析,P=0.05）及线粒体ROS产生增加（单因素方差分析,P＜0.0001）;透射电镜下可观察到血红素干预后细胞线粒体明显缩小,线粒体膜电位降低;上述改变可通过在培养体系中添加铁死亡抑制剂Lip-1缓解。结论:血红素可引起铁累积、脂质过氧化损伤诱导肠上皮细胞铁死亡发生,是输血相关NEC肠道损伤的潜在发生机制。