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研究背景及目的:自体静脉移植(autologous vein grafting,AVG)是治疗冠状动脉及周围动脉缺血的重要方法。但是它的长期通畅率仍然受静脉桥病变如动脉硬化,斑块形成的显著影响。文献报道静脉移植术后的前两年约有20%-40%的患者会出现桥血管腔狭窄,故预防静脉移植后狭窄及提高远期通畅率已成为当今心血管病防治研究的一个重要方向。研究表明静脉移植后狭窄的病理机制是以血管内皮损伤作为始动环节的,随后是巨噬细胞的粘附和浸润,以及平滑肌细胞向内膜迁移和过度增殖。尽管与冠状动脉粥样硬化疾病和血管成形术后的狭窄在病因及流行病学上有所不同,但是静脉桥移植后的狭窄和前两者具有一个共同的病理生理学阶段:即内皮完整性被破坏和新生内膜的形成(新生内膜的主要成分是过度增生的平滑肌细胞)。因此如何保护血管内皮或者早期恢复损伤的内皮功能,成为目前研究的重点。干细胞(stem cell)是当今器官和组织修复研究的热点,它是一类具有自我复制和分化潜能的未分化细胞,在适宜的条件下,可以分化为不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。近几年的研究发现,成体中的干细胞具有可塑性,在特定的条件下可跨系统、跨胚层分化为其它组织的细胞,称为横向分化。成体干细胞中研究最广泛的是骨髓中的造血干细胞和间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)。研究发现,BMSCs在体内外不同的微环境中可以被诱导分化为多种细胞。由于BMSCs具有易于分离培养和体外扩增,并可自体移植无免疫排斥反应的特点,因此利用BMSCs的横向分化潜能,可以根据需要将其诱导分化为特定的组织细胞,用以修复受损的组织或器官。已有大量证据表明骨髓起源的前体细胞或者干细胞能促进缺血组织的血管新生和梗死心肌的再生。本研究的目的是通过将BMSCs经血管移植到袖套管法建立的大鼠AVG模型中,观察BMSCs移植后向血管内皮分化的情况,以及对静脉桥血管新生内膜形成的影响,探讨BMSCs移植预防静脉桥移植物狭窄的可行性。方法:采用体重为100g左右的雄性wistar大鼠用于分离和获取BMSCs。首先通过贴壁培养法从供体大鼠骨髓中分离BMSCs,用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基扩增培养3代;观察不同培养时间的细胞形态,并用流式细胞仪检测表达CD90、CD44、CD34、CD45的阳性细胞数,以鉴定BMSCs的表型。然后经促进内皮生长分化的细胞因子联合诱导,体外观察BMSCs向内皮方向的分化。移植前用二氨基苯基吲哚(DAPI)标记细胞。采用体重250-300g雄性wistar大鼠作为AVG模型动物。将AVG模型动物分为三组(每组各26只):正常对照组、AVG模型组和BMSCs移植组。取大鼠左侧颈外静脉2cm上下倒置后用袖套管法将其移植到同侧的颈总动脉,制作AVG动物模型。AVG术后立即将标记的BMSCs通过尾静脉注射移植到体内。分别于移植后的2w和4w取静脉移植物,通过CD31和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)免疫荧光染色来观察移植细胞的存活以及分化为内皮细胞的情况;通过Real-time PCR和western blot分析eNOS和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,来检测内皮功能的恢复情况;并进行增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色及HE染色观察移植后新生内膜增生情况,计算新生内膜、平滑肌层的厚度。分析各组之间各项指标的统计学差异。结果:原代培养4d时形成由BMSCs组成的细胞集落;约7～8d时,集落内细胞密集,细胞分裂相减少;用胰蛋白酶消化传代培养,传代细胞增殖较快,约5d可传一代,传至3代时细胞基本纯化,传代细胞呈较均一的长梭形。经流式细胞仪检测细胞呈CD90+、CD44+、CD45-、CD34-,表明培养的细胞具备基质干细胞的特性。诱导前BMSCs不表达CD31,经多种促内皮生长分化的细胞因子联合诱导5d后部分BMSCs开始表达内皮细胞标志CD31。体外培养的细胞DAPI标记率达100%。利用袖套管技术成功建立大鼠同侧颈外静脉移植到颈总动脉的AVG模型。BMSCs移植后2w血管移植物的内膜部位有DAPI阳性的移植细胞聚集,并分化为CD31和eNOS阳性的内皮细胞,未检测到移植细胞分化为α-SM-actin阳性的平滑肌细胞;BMSCs移植组桥血管壁中PCNA阳性率较AVG模型组显著降低(P＜0.05);Real-time PCR和western blot检测结果也表明细胞移植后桥血管中eNOS表达均较AVG模型组明显增高(P＜0.05),内皮功能明显改善。iNOS的的表达仅在Real-time PCR检测的mRNA水平有明显增高(P＜0.05),而在westernblot检测的蛋白水平则无明显变化。移植后4w的HE染色发现AVG模型组的新生内膜和中膜的厚度分别为(262.20±36.91μm)和(80.42±15.20μm),BMSCs移植后新生内膜厚度(30.93±8.07μm)明显减小(P＜0.05),中膜的厚度(54.27±9.31μm)与模型组相比也有显著统计学差异(P＜0.05)。结论:利用袖套管法建立大鼠颈外静脉到颈总动脉的移植模型,手术简便易行,成功率高,死亡率低。BMSCs在体外经多种促内皮生长分化的细胞因子联合诱导可分化为内皮细胞;BMSCs的移植可以促进AVG术后移植静脉桥血管的早期再内皮化,改善内皮细胞的功能,抑制内膜的过度增生。因此BMSCs移植可能成为防治AVG术后早期狭窄的一个新的治疗手段。