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目的三阴性乳腺癌是乳腺癌的一个亚型,具有易复发、易转移,预后较差的特点,是临床治疗的难题之一。本论文以树枝状大孔介孔硅（DLMSNs）为载体高效共载近红外光敏剂IR780和化疗药物阿霉素（DOX）,并利用表面包覆白细胞/血小板融合膜的策略,构建具有肿瘤靶向性能的多功能仿生纳米治疗体系（WPDDI）,以期高效联合IR780介导的光热/光动力疗法（PTT/PDT）与DOX介导的化疗,获得对三阴性乳腺癌的协同治疗作用。内容本论文分为以下三部分内容:第一部分为WPDDI的制备与表征,包括WPDDI的制备及其表面功能蛋白、光学性质与载药性能的考察。第二部分为WPDDI的体外作用评价,包括PTT/PDT效率的体外评价以及体外药物释放性质的考察;被乳腺癌细胞特异性摄取与逃逸免疫细胞吞噬能力的评价;细胞毒性与细胞凋亡诱导效应的考察等。第三部分为WPDDI的体内研究,主要包括三阴性乳腺癌小鼠皮下移植模型的构建;体内靶向性与PTT/PDT效应评价;联合PTT/PDT与化疗的协同抗肿瘤作用评价。方法1.WPDDI的制备和表征:采用双模板法合成DLMSNs,随后与IR780和DOX混合并于室温下搅拌制备载药DLMSNs（DDI）;从小鼠血液中分离并提取血小板膜PLTm,培养并收集Raw264.7细胞,提取白细胞膜WBCm;采用超声的方法将PLTm与WBCm进行融合并修饰于DDI表面,制备WPDDI。利用透射电镜（TEM）观察DLMSNs,DDI,WPDDI的形貌特征;采用动态激光散射法测定其粒径与粒径分布,利用Zeta电位测定仪检测其表面荷电性质;通过考察放置过程中粒径的变化评价纳米体系的稳定性;采用考马斯亮蓝染色法进行全蛋白分析,并运用流式细胞术检测功能蛋白的表达;采用紫外分光光度计（UV）检测WPDDI的光学性质以及DOX与IR780的载药量。2.WPDDI的体外作用评价:分别采用红外热成像仪与单线态氧荧光探针（Singlet Oxygen Sensor Green,SOSG）监测DDI与WPDDI在溶液中的光热与光动力效率;采用动态透析法考察DDI与WPDDI在不同pH释放介质中,以及有无激光照射条件下DOX的释放情况;运用共聚焦显微镜和流式分析术考察鼠源乳腺癌4T1细胞与单核巨噬Raw264.7细胞对WPDDI的摄取情况,评价WPDDI对肿瘤细胞的靶向性及其逃逸免疫细胞识别的能力;采用MTT法和死/活细胞染色法考察WPDDI对4T1的细胞毒性作用;通过流式细胞术考察WPDDI对4T1细胞凋亡的诱导效应;通过对实验结果的分析比较,综合评价WPDDI联合PTT/PDT与化疗对乳腺癌细胞的协同杀伤作用。3.WPDDI的体内评价:构建小鼠三阴性乳腺癌4T1皮下移植瘤模型;运用小动物活体成像仪考察WPDDI静脉注射给药后在小鼠体内的组织分布,评价其体内肿瘤靶向性;采用红外热成像仪检测给药后激光照射下小鼠肿瘤部位的升温情况,考察WPDDI的体内光热效率;采用SOSG探针法检测小鼠肿瘤部位ROS的生成水平,评价WPDDI的体内光动力效率。尾静脉注射给药并行肿瘤局部激光照射,而后连续20 d监测肿瘤体积与小鼠体重变化,考察WPDDI对4T1肿瘤体内生长的抑制作用,并初步评价其体内毒性;治疗结束后,取小鼠体内主要脏器与肿瘤组织行苏木素-伊红（H&E）染色、DNA缺口末端标记（TUNEL）与CD31免疫荧光染色,检测组织病理学变化、肿瘤细胞坏死以及血管生成情况,综合评价WPDDI联合PTT/PDT与化疗对乳腺肿瘤体内生长的抑制效应。结果1.实现了DLMSNs对IR780和DOX的高效共载,以及白细胞/血小板融合细胞膜在载药硅球DDI表面的有效包覆,成功获得WPDDI。动态激光散射法检测DLMSNs、DDI、WPDDI的粒径分别为141.1、143.6与153.9 nm;其Zeta电位检测数据分别为-20.5、-5.03与-26.9 mV;TEM照片显示DDI表面具有明显的细胞膜包覆层;考马斯亮蓝染色与流式细胞仪分析结果表明,WPDDI表面的细胞膜包覆层具有Raw264.7细胞与血小板的特征蛋白表达。UV检测结果显示WPDDI成功负载了IR780与DOX,载药量分别为13.3%与10%。与游离IR780相比,DDI与WPDDI均具有更强的光学稳定性。2.近红外激光（808 nm,2 W/cm2）照射下,WPDDI溶液升温至55.5℃并维持温度相对稳定,同时伴随单线态氧（1O2）的大量生成,表明WPDDI具有较高的体外光热与光动力效率。体外释药实验结果表明,DOX在pH 6.5与7.4的PBS溶液中120 h后的释放量分别为57.2%与33.1%;相同释放条件下激光照射后,DOX的释放量分别升至70.5%与49.4%,说明WPDDI具有pH与光热双重响应性释药能力。和DDI以及单种细胞膜包覆的DDI（WDDI与PDDI）相比,乳腺癌4T1细胞对WPDDI的摄取能力显著增强,说明WPDDI具有一定的乳腺癌靶向性;和DDI相比,Raw264.7细胞对WPDDI的吞噬作用显著降低,说明WPDDI能够在一定程度上逃逸免疫细胞的识别。与游离IR780与游离DOX比较,WPDDI结合激光照射治疗后表现出更强的细胞杀伤作用与细胞凋亡诱导效应,证明其具有协同增效的抗乳腺癌作用。3.成功构建小鼠三阴性乳腺癌4T1皮下移植瘤模型。静脉注射给药后,WPDDI在4T1荷瘤小鼠体内表现出良好的肿瘤靶向性,显著延长了IR780的体内循环时间,并有效递送IR780至肿瘤病灶。激光照射后,WPDDI在小鼠体内表现出较高的PTT/PDT效应,肿瘤局部升温高达55℃,并伴随1O2的大量生成,单次治疗后几乎完全抑制了乳腺肿瘤的体内生长。治疗后肿瘤组织的H&E、Tunel与CD31免疫组化染色实验结果表明,WPDDI结合激光照射能够诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管新生。小鼠体重在治疗期间无显著性变化,治疗结束后也未在其主要脏器中观察到明显的组织病理学改变,说明WPDDI不会造成体内毒性,具有较高的生物安全性。以上实验结果表明,WPDDI能够高效联合PTT/PDT与化疗,发挥对乳腺癌协同增效的治疗作用。结论本研究以DLMSNs为载体,实现了近红外光敏剂IR780与化疗药物DOX的高效共载,并采用白细胞/血小板融合细胞膜表面修饰的策略,成功构建了仿生纳米载药体系WPDDI。体内外实验结果显示,WPDDI具有较高的光热/光动力效率与优良的乳腺癌靶向性,结合激光照射后表现出对4T1肿瘤显著的杀伤作用和对肿瘤血管新生的抑制效应。综上可见,本研究构建的WPDDI成功实现了化疗、光热/光动力对三阴性乳腺癌的联合治疗。