RNA干扰YES相关蛋白基因对肝癌细胞Huh-7增殖和凋亡的影响

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目的:采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,观察YAP基因对人肝癌细胞系Huh-7增殖凋亡的影响以及肝癌组织中YAP基因的表达情况,探讨YAP基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法:①设计制备针对YAP基因的小干扰RNA序列,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系Huh-7,流式细胞仪检测转染效率,寻求最佳转染效率的条件;②采用RT-PCR以及Western blot检测YAP-siRNA转染后肝癌细胞系Huh-7细胞YAP在mRNA和蛋白水平表达情况,验证siRNA的沉默效果;③分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,流式细胞术(FCM)检测计算空白组、未转染组和转染组细胞的吸光度值,细胞周期以及细胞凋亡的情况,观察YAP基因对Huh-7细胞增殖凋亡的影响;④将63例肝癌标本按肿瘤直径小于3cm分为小肝癌组和非小肝癌组。Real-time PCR法测量标本中YAP的表达水平,在组织水平上进一步验证YAP基因对肝癌细胞生长的影响。结果:①细胞数约为每孔1.5×105个、siRNA为80pmol,Lipofectamine2000与siRNA比例为4ul:4ul(6孔板)时,有最佳的转染效率(98.6%),继续提高siRNA浓度并不能明显提高转染效率;②转染YAP-siRNA后转染组细胞YAP的mRNA和蛋白表达明显下降(p<0.05);③转染了YAP-siRNA的肝癌细胞Huh-7吸光度值降低,增殖活力下降,生长缓慢,细胞凋亡增加(转染组凋亡率29.3%,p<0.05),对细胞周期无明显影响(p>0.05);④非小肝癌组的YAP表达水平是小肝癌组的3.61倍(p<0.05)。结论:①YAP-siRNA能有效沉默肝癌细胞株Huh-7YAP基因的过表达;②YAP-siRNA可抑制肝癌细胞株Huh-7增殖并能加速其凋亡;③YAP表达水平与肿瘤体积呈正相关。
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