第一部分GelMA-MBGNs化学交联支架的制备及表征【目的】构建甲基丙烯酸酐(MA)改性明胶(Gel)-介孔生物活性玻璃纳米颗粒(MBGNs)化学交联支架(GelMA-MBGNs),并研究其理化特征及生物矿化性能。【方法】利用MA对Gel改性,获得15%(w/v)GelMA溶液;以正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)以及四水硝酸钙(CNT)为原料,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为模板剂,以及Tris-HCl缓冲液(p H=8)为催化剂,合成MBGNs纳米颗粒;利用硅烷偶联剂APTES对MBGNs进行氨基化改性(APTES-MBGNs);将交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入15%(w/v)GelMA溶液并混匀,添加APTES-MBGNs充分反应,获得GelMA-MBGNs颗粒;随后将颗粒完全溶入光引发剂溶液(1 wt%Irgacure 2959),再加入15%(w/v)GelMA溶液并混匀,UV照射下进行光聚合反应,获得不同MBGNs质量分数比例(1 wt%,3 wt%以及5 wt%)的GelMA-MBGNs化学交联支架。在相同反应条件下,将15%(w/v)GelMA溶液与MBGNs混合,获得相应MBGNs比例的GelMA/MBGNs物理共混支架。通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察显微结构,傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)分析构象,失重率分析结构的稳定性,吸水率分析亲水性能,生物力学测试检测力学性能,以及SEM观测支架的矿化程度。【结果】SEM下GelMA为海绵样结构,孔道连通性好,孔径150±20μm;MBGNs为大小均一的规则球形颗粒,分散性能好,粒径250±30 nm;GelMA-MBGNs和GelMA/MBGNs两种支架的显微形貌无明显区别,孔隙连通性均较好,MBGNs颗粒在凝胶孔隙内分布均匀,随着MBGNs比例增加,颗粒增多。MBGNs比例相同时,两种支架的孔径相比,差异均无统计学意义(均p>0.05);而随着比例增加,两种支架的孔径均无明显变化(均p>0.05)。GelMA-MBGNs的FTIR图显示GelMA与MBGNs之间有新化学键(C-N)的形成。10 d以后,相同MBGNs比例的GelMA/MBGNs的失重率均大于GelMA-MBGNs(均p<0.05);随着时间延长,两种支架的失重率均下降,但GelMA-MBGNs下降幅度较GelMA/MBGNs小;而MBGNs比例越大,失重率下降程度越大。相同MBGNs比例的GelMA/MBGN的吸水率均大于GelMA-MBGNs(均p<0.05);随着时间延长,两种支架的吸水率均增加(均p<0.05);而随着MBGNs比例增加,两种支架的吸水率均降低(均p<0.05),GelMA/MBGNs降低幅度大于GelMA-MBGNs。相同MBGNs比例的GelMA-MBGNs的压缩强度和压缩模量均大于GelMA/MBGNs,而仅当MBGNs为3 wt%时,差异才有统计学意义(p<0.05)。相同MBGNs比例的两种支架表面形成的HCA层厚度相近;而随着MBGNs比例增加,矿化层更厚,覆盖范围更广。【结论】GelMA-MBGNs化学交联支架的结构稳定性,亲水性,以及力学性能均优于GelMA/MBGNs物理包埋支架。当MBGNs为3 wt%时,GelMA-MBGNs的力学性能最佳。而GelMA-MBGNs支架与GelMA/MBGNs支架的体外矿化能力相近。第二部分GelMA-MBGNs/rhBMP-2骨修复材料的制备及表征【目的】利用GelMA-MBGNs化学交联支架作为rhBMP-2的控释载体,构建具有高效成骨活性的GelMA-MBGNs/rhBMP-2骨修复材料,并研究其理化特征及生物矿化性能。【方法】制备直径为5 mm且高度为2 mm的GelMA-MBGNs(3 wt%MBGNs)支架,完全浸入5μg/ml rhBMP-2溶液孵育,抽真空,冷冻干燥,获得GelMA-MBGNs/rhBMP-2活性骨修复材料。同法制备GelMA/rhBMP-2作为对照。通过SEM观察微观形貌,ELISA法检测体外rhBMP-2释放特点,称重法检测体外降解性能,电感耦合等离子体发射光谱检测硅钙磷离子释放特点,以及SEM、FTIR及XRD评估矿化能力。【结果】GelMA-MBGNs/rhBMP-2和GelMA/rhBMP-2均表现为双相释药特点,在初期爆发性释放以及后期持续缓慢释放rhBMP-2,而前者释放相对缓和,后期持续时间更长。两种材料在体外均经历先快后慢的降解特点,而GelMA-MBGNs/rhBMP-2延长了降解时间。GelMAMBGNs/rhBMP-2和GelMA-MBGNs均具有与MBGNs相似的Si2+和P3+释放特点,但释放速度均较后者缓和;而Ca2+释放有所区别,浓度在一定范围内波动,而MBGNs先急剧下降,再缓慢下降。GelMA-MBGNs/rhBMP-2表面的HCA矿化层较GelMA/rhBMP-2厚,覆盖范围更广。FTIR及XRD证实了材料表面HCA的形成。【结论】GelMA-MBGNs/rhBMP-2中rhBMP-2早期突释显著降低,而后期缓释时间更长;具有与MBGNs相似的Si2+及P3+离子释放特点,但速度相对较慢,而Ca2+释放有所区别;生物矿化活性较GelMA/rhBMP-2强。第三部分GelMA-MBGNs/rhBMP-2促进体外成骨的作用及机制【目的】探讨GelMA-MBGNs/rhBMP-2促进BMSCs黏附、增殖,以及成骨分化的能力。【方法】通过密度梯度离心法获得大鼠BMSCs,利用流式细胞仪(FAC)鉴定,进行原代和传代培养,观察细胞形态特征,描绘生长曲线。以GelMA水凝胶、GelMA-MBGNs支架,以及GelMA-MBGNs/rhBMP-2为实验组,而无任何材料为空白对照组。将第三代BMSCs悬液按一定密度与材料共培养,在不同时刻通过SEM观察细胞黏附及铺展情况;利用FITC-鬼笔环肽及DAPI荧光染色,观察细胞骨架和胞核形态;利用CCK-8法检测细胞增殖率,以及死/活细胞荧光染色检测生存状况。将材料置于Transwell板上室,BMSCs置于下室,在不同时刻通过ALP染色和活性检测,矿化结节染色和钙含量测定,q RT-PCR检测ALP m RNA、Runx2 m RNA、Col-Ⅰm RNA、OPN m RNA以及OCN m RNA的表达,以及OCN细胞免疫荧光染色,评估BMSCs成骨分化情况。【结果】第三代BMSC呈均一的长梭形,漩祸状生长。阳性标记物CD90和CD105分别表达94.18%和92.33%,而阴性标记物CD11b和CD34分别表达5.74%和1.77%。SEM表明三组细胞均不同程度地黏附及铺展,随着时间延长,铺展面积增加。细胞骨架和细胞核荧光染色表明,细胞黏附及铺展良好。共培养第3 d、7 d及9 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组的细胞增殖(OD值)>GelMA-MBGNs组>GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05);随着时间增加,每组OD值均增加(均p<0.05)。在相同时刻,材料组活细胞比例(P活)和活细胞密度(D活)均接近,差异均无统计学意义(均p>0.05);随着时间延长,三组数值均无明显降低,差异均无统计学意义(均p>0.05)。GelMA-MBGNs/rhBMP-2组ALP阳性反应出现最早,染色最深;第7 d,各组ALP活性相比,差异无统计学意义(p>0.05);第14 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组高于GelMA-MBGNs组和GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05),而GelMA-MBGNs组与GelMA组相比,差异无统计学意义(p>0.05);第14 d与第7 d相比,各组ALP活性均增加,差异均有统计学意义(均p<0.05)。第7 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组的钙含量>GelMA-MBGNs>GelMA组,差异有统计学意义(p<0.05);第21 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组钙含量均高于GelMAMBGNs组和GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05),而GelMA-MBGNs组与GelMA组相比,差异无统计学意义(p>0.05);随着时间延长,各组钙含量均增加,差异均有统计学意义(均p<0.05)。第3 d,7 d以及14 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组ALP m RNA和Runx2 m RNA表达量均高于GelMA-MBGNs组和GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05);第3 d和7 d,Col-I m RNA的表达量均高于GelMA-MBGNs组和GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05);第7 d和14 d,OPN m RNA和OCN m RNA的表达量均高于GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05)。第21 d,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组OCN细胞免疫荧光反应阳性最强,阳性细胞分布最广。【结论】GelMA-MBGNs/rhBMP-2显著促进BMSCs黏附、铺展、增殖,以及向成骨细胞分化。第四部分GelMA-MBGNs/rhBMP-2修复骨缺损的研究【目的】探讨GelMA-MBGNs/rhBMP-2促进体内新骨和血管生成的能力,以及修复大鼠颅骨缺损的可行性。【方法】利用24只成年SD大鼠制备双侧颅骨临界骨缺损模型(直径5 mm),一共获得48个颅骨缺损,根据植入材料不同,随机分为空白对照组、GelMA组、GelMA-MBGNs组,以及GelMA-MBGNs/rhBMP-2组。分别于术后4 w和8 w取颅骨标本,通过大体观察骨缺损表面情况,Micro-CT扫描及图像分析软件计算新生骨小梁体积分数(BV/TV),以及组织学HE染色、Masson染色及免疫组化染色(Col-Ⅰ和CD31)定性及定量分析新骨及血管生成的程度。【结果】术后所有动物的精神状态,活动,步态,饮食,以及二便均正常。切口无红肿、渗出,或皮肤坏死。术后4 w,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组的新生骨小梁体积分数(BV/TV,%)大于GelMA-MBGNs组,GelMA-MBGNs组大于GelMA组,但差异均无统计学意义(均p>0.05);而GelMA-MBGNs/rhBMP-2组大于GelMA组,差异有统计学意义(p<0.05)。术后8 w,GelMAMBGNs/rhBMP-2组>GelMA-MBGNs组>GelMA组,差异有统计学意义(p<0.05)。术后8 w与4w相比,每组BV/TV均明显升高,差异均有统计学意义(均p<0.05)。术后4 w,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组的新生骨面积百分比(HE染色)大于GelMA-MBGNs组,但差异无统计学意义(p>0.05);而GelMA-MBGNs/rhBMP-2组和GelMA-MBGNs组均大于GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05)。术后8 w,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组>GelMA-MBGNs组>GelMA组,差异有统计学意义(p<0.05)。术后8 w与4 w相比,每组新生骨面积均增加,差异均有统计学意义(均p<0.05)。术后4 w,GelMA-MBGNs/rhBMP-2组的新生血管数量(CD31免疫组化染色)大于GelMA-MBGNs组,GelMA-MBGNs组大于GelMA组,但差异均无统计学意义(均p>0.05);而GelMA-MBGNs/rhBMP-2组大于GelMA组,差异有统计学意义(p<0.05)。术后8 w,GelMAMBGNs/rhBMP-2组大于GelMA-MBGNs组,但差异无统计学意义(p>0.05);而GelMA-MBGNs/rhBMP-2组和GelMA-MBGNs组均大于GelMA组,差异均有统计学意义(均p<0.05)。术后8 w与4 w相比,每组新生血管数均降低,差异均有统计学意义(均p<0.05)。【结论】GelMA-MBGNs/rhBMP-2可显著促进体内新骨和血管生成,促进颅骨临界骨缺损修复的能力显著优于GelMA-MBGNs支架和GelMA水凝胶支架。