[背景]人类肠道病毒(HEV)是一类在人类肠道中繁殖的常见病毒,根据生物学及遗传特性HEV被划分为A、B、C、D共4个基因组。HEV感染可引起多种疾病。无菌性脑膜炎(AM)主要是由各种病毒引起的一组以精神和意识障碍为突出表现的中枢神经系统感染性疾病,轻者能自行缓解,危重者可导致后遗症及死亡。文献报道AM全球每年发病率为11～27/10万。在所明确引起AM的病原体中,HEV约占85%～95%。20世纪80年代以来,随着全球成功开展消灭脊髓灰质炎活动,许多国家已相继实现无脊髓灰质炎目标,与此同时,由非脊髓灰质炎肠道病毒(NPEV)引起的各类疾病如AM和手足口病(HFMD)的发病近年一直呈上升趋势。本研究从1994～2008年山东省急性弛缓性麻痹病例(AFP)的常规监测中分离到大量的HEV～B,同时对部分引起疾病暴发的优势毒株进行了序列的测定和同源性分析,初步建立起HEV-B山东地方株的VPl区全基因数据库。本研究对于明确山东省HEV～B基因型的分布,以及通过分子流行病学方法阐明疾病的发生与病毒的遗传进化之间的内在联系均具有重大的理论和现实意义。[研究的目的]1.描述山东省1994～2008年HEV-B的分离情况,研究HEV-B山东地方株的基因型分布；2.建立HEV-B山东地方株的VP1完整编码区基因数据库；3.分析HEV-B部分优势毒株的VPl完整编码区基因序列的特征,并与国外和国内其他省份的分离株进行比较,分析其进化来源；4.探讨HEV-B主要型别与其所致疾病之间的联系,分析遗传变异对其致病性和流行规律的影响,为相关疾病的预防控制提供理论依据。[研究方法]1.对1994-2008年山东省AFP监测系统中的病例标本以及2003～2008年3次AM暴发中的部分病例标本,采用细胞培养的方法进行病毒分离。对分离到的阳性分离物采用组合血清进行中和试验,确定其血清型。2.按照毒株的分离年份及分离地点,选取具有代表性的部分毒株进行核酸的提取和VPl区序列的测定。3.将测得的基因序列进行剪裁、拼接,利用NCBI提供的BLAST服务器进行序列比对,确定HEV-B山东地方株的基因型别。4.将HEV-B山东地方株与GenBank中检索到的其它国家和地区分离株,采用BioEdit Sequence Alignment Editor software 5.0.9软件,对其VP1区核苷酸序列及其推导氨基酸序列进行同源性比较。5.采用Mega4.1软件,以相邻连接方法(Neighbor-joining Method)构建VP1区系统发生树,对HEV-B山东地方株进行亲缘进化分析。[主要结果]1.山东省HEV-B的分离情况：1994～2008年山东省AFP病例的粪便标本共分离出NPEV 1021株,各年度的分离率在7.7%-17.2%之间；2003～2008年山东省3次AM暴发,其病原体均属于HEV-B,分别为CVB3、CVB5和ECH030。2.HEV-B山东地方株基因型分布及其VPl区全基因进化树：HEV-B山东地方株分属于29个基因型,其中ECHO11、CVB3、ECHO6、ECHO14、ECHO25是分布最为广泛的HEV-B；各基因型HEV-B无明显的地区分布。山东省HEV-B可以分为3个簇(Cluster), Cluster1包括ECH030在内的12种ECHO病毒,Cluster2包括CVB 1-5, Cluster3包括ECHO 12在内的另外11种ECHO病毒及CVA 9。每种血清型病毒单独成簇。3.主要的HEV-B山东地方株遗传进化分析(1)HEV-B山东地方株VPl区全基因数据库的建立及其同源性分析：根据VP1区全基因数据库毒株备选原则,从山东省AFP病例中分离到的HEV-B中选取171株,与HEV-B所致疾病暴发中的33株分离株,一起构建了山东地方株VP1区全基因数据库。VP1区全基因序列同源性分析显示：山东地方株型内核苷酸差异最大的为ECHO1(6.7%-24.6%),差异最小的为CVB4(2.9%-5.6%)；CVB2与其原型株相比核苷酸差异最小(4.8%-7.7%),EV73型与其原型株相比核苷酸差异最大(24.6%)。(2)CVB3山东地方株遗传进化分析：CVB3山东地方株与原型株之间的核苷酸同源性为77-8%-80.0%,氨基酸同源性为96.1%-97.5%。分离株177/2008TC/SD/CHN的核苷酸变异位点及变异结果与其余4株都有较大的差异；5株山东地方株氨基酸变异的数目为9或10。CVB3毒株可划分为A、B、C共3个基因型,山东地方株分布在A基因型内。A1-A3 3个基因亚型内的山东地方株分离年份依次为2004～2008年、1994～2002年、2004年和2008年。(3)CVB5山东地方株遗传进化分析：CVB5山东地方株与原型株之间的核苷酸同源性为81.2%-81.6%,氨基酸同源性均为96.8%；山东地方株之间的核苷酸同源性为83.0%-94.6%,氨基酸同源性为96.4%-100.0%。在VP1完整编码区中核苷酸的变异位点分布较为均匀,也没有显示时间上的聚集性。相对于原型株,山东地方株发生了9个氨基酸变异。CVB5毒株划分为A、B、C、D 4个基因型,山东地方株分布在C和D两个基因型内。进化树中与山东地方株同源性最近的是浙江分离株Cox B5/Zejiang/12/02 (CSF)。(4)ECH06山东地方株遗传进化分析：ECH06山东地方株之间的核苷酸同源性为77.6%～98.6%,氨基酸同源性为93.7%-99.6%,与原型株之间的核苷酸同源性为75.2%-78.8%,氨基酸同源性为92.7%-95.5%。VP1完整编码区核苷酸的变异显示出时间上的聚集性；氨基酸的变异存在三处变异较为密集的区域,变异数目为13-21。ECH06毒株划分为A、B、C共3个基因型,山东地方株分布在B和C两个基因型内。山东地方株来源于3个不同的进化分支。(5)ECHO11山东地方株遗传进化分析：ECHO11山东地方株之间的核苷酸同源性为76.4%～100.0%,氨基酸同源性为91.4%-100.0%；ECHO11山东地方株与原型株Gregory之间的核苷酸同源性为77.7%-80.7%,氨基酸同源性为90.7%-94.8%。ECHO11山东地方株氨基酸变异数目大于20,存在时间上的聚集性以及变异较为密集的区域。ECHO11毒株划分为A、B、C、D 4个基因型,山东地方株分布在A和C两个基因型内。山东地方株构成了A1、A2和C1共3个新的基因亚型,A1基因亚型内的毒株均分离自1998年之后,A2和C1两个基因亚型内的毒株均分离自1994-1997年。(6)ECHO19山东地方株遗传进化分析：ECHO19山东地方株之间的核苷酸同源性为83.3%～98.6%,氨基酸同源性为98.6%～99.3%。山东地方株与原型株之间的核苷酸同源性为78.6%～79.2%,氨基酸同源性为97.6%～99.3%。核苷酸与氨基酸的比对结果显示：氨基酸变异数目大于20,分离年份相近的毒株之间基因序列变异情况相似,毒株97206/SD/CHN/1997/E19基因序列变异与其他分离株相比差异较大。进化树显示9株国内毒株存在集聚现象,形成一个基因簇。(7)ECHO30山东地方株遗传进化分析：ECHO30山东地方株与原型株之间的核苷酸同源性为81.9%～83.5%,氨基酸同源性为92.4%～93.1%；山东地方株之间的核苷酸同源性为86.0%～98.5%,氨基酸同源性为96.9%～98.9%。毒株06350/SD/CHN/2006/E30与其他山东地方株之间的同源性较小。核苷酸的变异情况显示：06530/SD/CHN/2006/E30和017/2008TC/SD/CHN 2株毒株与其他山东地方株的变异数目和变异位点均存在较大差异。山东地方株氨基酸变异数目大于20。ECHO30毒株划分为A～E共5个基因型,国内株全部分布在E基因型内,山东地方株分布在E1、E3两个基因亚型内。4.部分HEV-B山东地方株引起的AM暴发：2003年章丘市AM暴发中各年龄别罹患率在7岁前随年龄增加而有所升高,7岁后随年龄的增加而减少。患者具有较为明确的接触史,神经系统症状较为明显。引起此次疾病暴发病原体为单一的ECHO30病毒,与同时期山东省泰安市、浙江省和江苏省AM暴发中的分离株之间存在较为密切的流行病学联系。2005年山东省兖州市AM暴发以6岁以下儿童为主,2岁以下婴儿罹患率最高。病例及其看护人均无明确的接触史,患者的临床症状较轻。引起此次疾病暴发的病原体为CVB5毒株,主要分离自脑脊液标本,与2002的浙江分离株CoxB5/Zejiang/12/02 (CSF)流行病学联系密切。2008年山东省郯城县AM暴发中1岁以下儿童发病数最多,各年龄别罹患率在随年龄增加而降低。大部分患者有AM病例接触史,临床症状相对较轻。引起此次疾病的病原体为CVB3,此次暴发由同一传播链的CVB3毒株所致,毒株与进化树中其他2008年的分离株同源性较近,为同一进化来源。[主要结论]1.HEV-B在山东省分布广泛,对人群健康存在着重要的影响,AFP病例监测系统每年可以分离到大量的NPEV；不同基因型毒株有不同的时间循环模式；某些优势基因型如CVB5、CVB3、ECHO30在山东省呈中度流行状态,优势毒株的变迁往往伴随着疾病的暴发。2.VP1区全基因序列同源性分析显示,各基因型HEV-B山东地方株与其原型株相比均发生了较大的变异,相对于ECHO病毒,CV病毒核苷酸的变异大多为同义突变,并没有引起氨基酸的变异；ECHO病毒在进化中较为活跃。3.相同基因型的HEV-B山东地方株内部,根据其遗传距离的远近可以划分为不同的基因亚型,进化树分析显示相同基因亚型毒株之间在地理和时间分布上存在着一定的聚集性。4.在山东省,HEV-B引起的疾病暴发仍以AM为主,在HFMD的流行中偶见HEV-B组病毒,多数疾病暴发中分离到的HEV-B为单一的血清型,这与HEV-A病毒之间常见的协同流行略有不同。5.对于部分HEV-B优势毒株的分子流行病学研究显示了其各自的流行特征：①CVB3山东地方株为原型株近似株而非变异株近似株,病毒在国内传播迅速,广泛流行,相同的年份有多个传播链的CVB3病毒在山东省流行；②CVB5毒株的变异进化速度相对较慢,进化树中D1基因亚簇内毒株2002-2005年在亚洲和欧洲的流行,导致了2002年浙江省和2005年山东省充州市AM的暴发；③ECH06毒株变异进化较为迅速,山东省近年流行株与往年流行株之间的核苷酸序列存在较大差异,可能与往年毒株为不同进化来源；④ECHO11病毒在进化上较为活跃,1994-1997年期间山东省存在两个差异较大的ECHO11基因亚型共循环,而A1亚型内的毒株为近年流行的基因亚型；⑤ECH019山东地方株的进化变异速度较慢,引起2003年泰安市疾病暴发的毒株在山东省流行广泛；⑥2003年章丘市AM暴发的ECH030分离株存在较大的抗原变异,感染性强,传播迅速,为山东省近几年的主要流行株,在2003-2008年山东省存在两个不同基因亚型的毒株流行。