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1目的:柿叶总黄酮(PLTF)是从中药柿叶中提取的有效部位,现代研究表明,柿叶黄酮具有血管扩张(软化血管)、抗氧化、增强机体免疫、止血、杀菌解热等多种功效,但是,PLTF对动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响未见报道。本实验通过建立载脂蛋白E敲除(apoE-/-)小鼠的胸腹主动脉及头臂干动脉粥样硬化模型,常规检测观察其对小鼠血脂、MDA含量和SOD活性的影响;运用HE、油红O染色方法观察其对实验小鼠AS斑块的组织形态学改变及病变面积的影响;运用免疫组化方法观察其对实验小鼠胸腹主动脉病变组织P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1以及头臂干动脉病变组织中α-actin、MMP-9的表达变化的影响,探查PLTF对动脉粥样硬化的治疗作用及其可能作用机制。方法:第一部分:柿叶总黄酮对apoE-/-小鼠胸腹主动脉粥样硬化病变的影响及机制研究实验动物共设三组,即⑴正常对照组,选用8周龄雄性C57BL/6正常小鼠8只;⑵模型组,选用8周龄雄性apoE-/-小鼠21只;⑶柿叶总黄酮治疗组(简称黄酮组),选用8周龄雄性apoE-/-小鼠21只。除正常对照组饲喂普通饲料外,其余两组均饲喂高脂饲料。所有动物自由饮水,每日灌胃一次,黄酮组给予柿叶总黄酮30 mg/kg/day,正常对照组、模型组均给予等量的生理盐水。连续饲喂16周,麻醉取血,测定血清中TC、TG、VLDL、MDA含量、总SOD活性;手术剥离胸腹主动脉近心端组织并切片,HE、油红O染色观察AS病变的组织形态学改变及病变面积;免疫组化法观察胸腹主动脉病变中P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1的表达及分布。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像分析。第二部分:柿叶总黄酮对apoE-/-小鼠头臂干动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及其机制研究实验动物共设四组,即:⑴正常对照组,选用8周龄雄性C57BL/6正常小鼠8只;⑵模型组,选用8周龄雄性apoE-/-小鼠28只;⑶柿叶总黄酮治疗组(简称黄酮组),选用8周龄雄性apoE-/-小鼠24只;⑷辛伐他汀治疗组(简称他汀组),选用8周龄雄性apoE-/-小鼠24只。除正常对照组饲喂普通饲料外,其余三组均饲喂高脂饲料,所有动物自由饮水,每日灌胃一次,黄酮组给予柿叶总黄酮30 mg/kg/day,他汀组给予辛伐他汀30 mg/kg/day,正常对照组、模型组均给予等量的生理盐水。连续饲喂12周,麻醉取血,测定血清中TC、TG、LDL、VLDL、HDL、MDA含量、总SOD活性;手术取头臂干动脉并切片,HE、油红O染色观察AS病变的组织形态学改变及病变面积;弹力纤维染色确定斑块内纤维帽数,免疫组化法检测头臂干动脉病变中α-actin、MMP-9的表达及分布。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行图像分析。结果:第一部分:柿叶总黄酮对apoE-/-小鼠胸腹主动脉粥样硬化病变的影响及机制研究1. PLTF对apoE-/-小鼠血清血脂的影响:模型组小鼠血清TC、TG、VLDL水平明显高于正常对照组(P<0.01),但模型组(40.51±3.47、3.81±0.42、1.73±0.19)和黄酮组(35.98±5.29、3.34±0.63、1.52±0.28)之间血脂水平无显著性差异。2. PLTF对apoE-/-小鼠血清MDA和SOD的影响:模型组小鼠血清中MDA含量(35.18±3.89)明显高于黄酮组与正常对照组血清中MDA的含量(24.15±3.18、22.27±2.19)(P<0.05);黄酮组和模型组之间SOD活(113.3±3.24、120.3±5.72)无显著性差异。3. PLTF对apoE-/-小鼠胸腹主动脉AS病变组织形态的影响:正常对照组小鼠胸腹主动脉内膜光滑,无AS病变,模型组小鼠胸腹主动脉内膜大多可见体积较大的斑块形成,斑块突入管腔导致管腔明显狭窄,黄酮组小鼠胸腹主动脉AS斑块面积较小,脂质、泡沫细胞沉积血管内膜,导致血管内膜局部增厚,无明显管腔狭窄。与模型组比较,黄酮组AS斑块面积与管腔面积之比明显降低(分别为0.15±0.03、0.07±0.02),差异有显著性(P<0.05)。4. PLTF对apoE-/-小鼠AS病变组织中粘附分子表达的影响:与正常对照组相比,模型组主动脉斑块肩部有广泛的P-Selectin、ICAM-1和VCAM-1阳性染色颗粒表达(163.08±16.33、155.02±13.98、153.91±9.88),而黄酮组中阳性染色颗粒表达较少(184.56±13.52、170.52±16.20、167.63±12.90),主要表达于血管内膜,且模型组病变部位灰度显著低于黄酮组,差异有显著性(P<0.05)。第二部分:柿叶总黄酮对apoE-/-小鼠头臂干动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及其机制研究1. PLTF对apoE-/-小鼠血脂的影响:与正常对照组TC、LDL、HDL、TG水平比较,模型组TC、LDL水平显著升高(P<0.05),HDL水平显著降低(P<0.05),TG水平也有升高,但无统计学意义。模型组、黄酮组和他汀组三组之间比较,各指标之间均无显著性差异。2. PLTF对apoE-/-小鼠血清MDA和SOD的影响:与模型组MDA含量(23.89±1.62)比较,正常对照组、黄酮组、和他汀组三组血清中MDA含量(18.38±1.60、18.31±1.78、16.76±1.94)明显降低(P<0.05),但三组之间无显著性差异;模型组、黄酮组、他汀组三组比较,血清SOD活性(104.26±11.19、100.15±9.74、102.39±10.15)无显著性差异。3. PLTF对apoE-/-小鼠头臂干动脉AS病变组织形态的影响:三组小鼠头臂干动脉内膜均有典型的纤维斑块或粥样斑块等AS病变形成,与模型组比较,黄酮组、他汀组大多AS斑块体积较小,且斑块面积与管腔面积之比显著降低(分别为0.33±0.07、0.12±0.02、0.14±0.04),差异有显著性(P<0.05)。4. PLTF对apoE-/-小鼠头臂干动脉AS斑块稳定性的影响:模型组头臂干动脉AS斑块包埋纤维帽数高于黄酮组和他汀组,其MMP-9的表达亦高于黄酮组和他汀组(分别为137.79±14.92、155.34±10.67、156.76±12.48),差异有显著性(P<0.05);三组中所有不稳定斑块MMP-9的表达明显高于稳定性斑块(分别为130.03±11.73、162.44±10.26),且差异有极显著性(P<0.01)。结论:1. PLTF可在一定程度上抑制apoE-/-小鼠AS病变的产生和发展,但并不依赖于其对血脂的降低作用。2. PLTF可显著对抗小鼠机体内脂质过氧化作用,从而抑制AS病变的发展,但并不是通过直接增强SOD活性来参与反应性的防御保护机制。3. PLTF可在一定程度上抑制AS病变组织中粘附分子P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1和基质金属蛋白酶MMP-9的表达,表明,PLTF可以通过减少小鼠动脉壁内P-Selectin、ICAM-1、VCAM-1的表达抑制AS的形成和发展,并通过减少MMP-9的表达增加斑块的稳定性。