论文部分内容阅读
烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)具有识别序列专一性高和酶切效率高的优点，常用于融合蛋白标签去除。为了提高TEVp的使用效率，本研究中，构建、表达和纯化了TEVp和其它融合蛋白，其N端融合纤维素结合模块(Cellulose-binding module，CBM)能将TEVp和4种彩虹蛋白固定于再生多空纤维素(Regenerated amorphous cellulose，RAC)，分析了游离态和固定化TEVp的性质，并可视化检测固定化TEVp柱上酶切融合蛋白，获得以下结果: 1.构建融合蛋白酶及其酶切融合底物:构建的TEVp的N端和C端分别含有CBM标签和组氨酸标签，同法构建失活突变体TEVpC151A的融合蛋白。选取4种彩虹蛋白即祖母绿绿色荧光蛋白(EmGFP)、樱桃红红色荧光蛋白(mCherry)、含有Fe-S簇的棕色玉米西罗叶绿三酸铁螯合酶(maize sirohydrochlorin ferrochelatase，ZmSF)和红色透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb），分别在其上游融合表达CBM，在标签和靶蛋白之间，加一个TEVp酶切序列，为提高切割效率，在CBM和VHb加两个酶切序列。另外以GST融合的大肠杆菌二氨基丙酸氨解酶(E.coli diaminopropionate ammonia-lyase，eDAL)和玉米丝氨酸消旋酶(maize serine racemase，ZmSR)为TEVp的底物。 2.重组蛋白的表达和纯化:所有融合蛋白均在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达，诱导条件是28℃，12h。收菌破碎后，Ni-NTA纯化融合TEVp，分别利用RAC吸附融合TEVp及其酶切底物融合蛋白。 3.游离态和固定化TEVp的性质分析:SDS-PAGE检测表明，经不同亲和介质纯化的TEVp都含有一定的杂质蛋白，每克RAC可吸附约220mgCBM-TEVp-H6。动力学分析表明，固定化TEVp的催化常数低于游离态蛋白酶。游离态TEVp在4℃保存10d后，酶活降低了约60％，而固定化TEVp经相同条件贮存后酶活仅降低了约22％，约2.1％的融合TEVp从RAC解离。固定化TEVp重复使用5次之后酶活性依然能达到约初始酶活的40％。 4.不同条件下固定化TEVp柱上酶切融合EmGFP的效率分析:以含有CBM标签的EmGFP作为底物，探究固定化TEVp柱上酶切最适反应条件。结果表明，融合底物与固定化蛋白酶以30∶1的浓度比例在35℃下反应3小时酶切反应已达到平稳期。 5.可视化观察固定化TEVp柱上酶切融合蛋白导致彩虹蛋白从RAC解离的效果。从RAC介质颜色判断，除EmGFP外，其余3种彩虹蛋白能有效从RAC解离，这种观察结果进一步得到SDS-PAGE分析验证。 综上所述，本研究证明RAC能有效固定TEVp和其它含有CBM标签的融合蛋白，固定化提高了TEVp的稳定性，并且固定化酶可重复使用，在一定程度上弥补了固定化后酶活性稍有降低的不足;柱上酶切释放彩虹蛋白易于快速简单检测酶切效果。由于RAC廉价且吸附能力强，固定化TEVp可作为一种移除融合标签的有效工具;不同颜色的彩虹蛋白系统可用于分析其它亲和标签和其它序列专一性蛋白酶的切割效率。