研究背景和研究目的在特定的体内外环境下，骨髓间充质干细胞（BMSC）能分化为神经细胞。骨髓间充质干细胞具有其它干细胞所不可比拟的优点，如取材方便，增殖和分化能力强，移植无免疫原性等。因此，诱导BMSC定向分化为神经细胞在临床上治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤修复具有广阔的应用前景。目前，国内外对骨髓间充质干细胞定向分化诱导研究多数还局限于对细胞分化后的鉴定，而对其分化调控机制了解很少。因此，研究骨髓间充质干细胞向神经元分化的分子机制是当务之急。神经干细胞（NSC）具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力。这种神经干细胞如能被特异性地诱导分化为某种特定神经元，以替代损伤的神经元，无疑将为神经系统疾病的治疗带来新的希望。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）在信号传递过程中具有重要作用，能特异性水解磷脂酰胆碱（PC）产生第二信使——二酯酰甘油（DAG），而DAG又可以激活蛋白激酶C（PKC），进一步把信号传递给丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），从而参与调控细胞增殖、分化和凋亡。本课题组在研究PC-PLC在细胞信号转导中的作用时，偶然发现PC-PLC的特异性抑制剂D609（tricyclodecan-9-yl-xanthogenate）能诱导部分人脐带静脉血管内皮细胞（hUVEC）分化为神经元样细胞，进一步研究发现D609能快速的诱导人骨髓基质细胞（hBMSC）定向分化成神经元样细胞。但是，D609是否能诱导多种不同来源的骨髓间充质干细胞分化为神经元?D609通过何种途径对骨髓间充质干细胞产生分化诱导作用?PC-PLC在分化过程有何作用?与PC-PLC关联的一些重要的信号分子，如活性氧（ROS）、NADPH氧化酶、核因子κB（NF-κB）、c-fos及视网膜母细胞瘤基因（Rb），是否参与此过程?D609是否同样可以诱导神经干细胞向神经元分化呢?这些问题目前均尚未搞清。因此，本论文旨在研究PC-PLC调节骨髓间充质干细胞和神经干细胞向神经元分化的分子机制，目前对PC-PLC在细胞分化信号转导中的作用了解较少，对于PC-PLC介导骨髓间充质干细胞分化的研究处于国际领先的地位，研究清楚该分化信号的转导途径，将对阐明细胞分化的分子机制具有推动作用。本研究选用骨髓间充质干细胞和神经干细胞两种多潜能的成体干细胞作为研究细胞分化信号转导的对象，为研究成体干细胞横向分化的分子机制和信号转导途径奠定了基础。通过诱导这两种成体干细胞定向分化为神经元，从而为在临床上治疗各种神经系统疾病提供理论依据。研究内容1．初步研究D609对几种不同来源的MSC的诱导分化作用，其中包括大鼠骨髓来源的MSC（rBMSC）、人骨髓来源的MSC（hBMSC）和人胎盘来源的MSC（hPMSC）2．利用rBMSC研究诱导条件的优化方案及分化细胞的功能特征3．研究PC-PLC介导的骨髓间充质干细胞分化中相关的重要分子及信号通路4．研究PC-PLC介导的神经干细胞分化、凋亡研究方法1．rBMSC分离、培养及鉴定：1) MSC的分离和培养，参考Pittenger的方法[Pittenger et al，1999]2)流式细胞术检测rBMSC的表面标志2．MSC向神经元分化检测：1)倒置相差显微镜观察细胞形态学变化2)免疫细胞化学检测神经元特异性蛋白NSE、NF-L和突触素3)参考Falchi的方法利用TMRM染色检测细胞线粒体膜电位[Falchi ct al，2005]4)参考Mao的方法利用TMRM染色检测细胞静息膜电位[Mao and Kisaalita 2004]3．PC-PLC活性检测：参考吴兴中等研究者的方法[Wu et al，1997]4．ROS检测：利用荧光探针（DCHF）并结合激光扫描共聚焦显微术检测5．SOD活性检测：利用SOD检测试剂盒6．NADPH氧化酶活性检测：参考Li的方法[Li et al，2002]7．细胞内蛋白水平及分布检测：1)免疫细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微术，检测Rb、膜整连蛋白β4及NF-κB蛋白的水平及分布2) Western blot方法，进一步检测Rb及c-los蛋白的水平8．NSC培养：NSC的分离和培养，参考Gritti的方法[Gritti et al，1996]9．细胞凋亡检测：1)倒置相差显微镜观察细胞形态变化2) MTT检测细胞存活率3)吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察，检测细胞核片断化4) LDH（乳酸脱氢酶）实验，检测细胞是否出现坏死5) TUNEL染色，检测细胞凋亡率研究结果：1．D609初步诱导MSC分化1．1从大鼠骨髓中分离获得rBMSC，经3代以上传代后，细胞成分均一，纯度在95％以上，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR，表达CD29、CD44、CD105和HLA-ABC。1．2 5-15μg／ml D609可诱导rBMSC向神经元样细胞分化，而3-8μg／ml D609可诱导hBMSC和hPMSC分化，诱导6h就可观察到这三种MSC呈现神经元样形态，48h部分细胞相互连接成网状结构，并且神经细胞特异性标记NSE、NF和突触素呈强阳性表达。D609对MSC的诱导分化作用呈现剂量依赖性（P＜0.01，P＜0.05）。随着诱导时间的延长和D609浓度的增加，对照组和实验组中细胞的存活率均下降。2．优化分化诱导条件2．1使用D609处理48h时：FGF-2处理组，细胞的分化率有部分升高（P＜0.05），细胞存活率升高（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05）；B27处理组，细胞的分化率显著降低（P＜0.01），B27细胞存活率显著升高（P＜0.01），凋亡率降低（P＜0.05）：10％小牛血清处理组，D609不能诱导MSC向神经细胞分化。2．2在诱导分化后维持培养8天，FGF-2处理组中分化细胞呈现典型的神经元形态，缺少FGF-2则导致细胞的大量死亡。细胞存活率检测结果表明FGF-2可以显著提高细胞的存活率（P＜0.01，P＜0.05）。3．分化细胞的功能特征诱导分化48h后，与未分化的rBMSC相比：分化细胞中线粒体的膜电势显著增加，随着培养时间的延长，线粒体膜电势进一步升高（P＜0.05）；分化的rBMSC具有比较低的静息膜电位，8天后，这种趋势更加明显。随着处理时间延长，分化细胞的线粒体的膜电势升高而静息膜电位逐渐下降，这些特征与神经元在体外培养过程中的变化趋势相一致。4．D609诱导rBMSC分化的分子机制4．1对细胞中PC-PLC活性进行检测发现，在rBMSC中存在两种形式的PC-PLC，分别为Ca²⁺依赖的PC-PLC和Ca²⁺非依赖的PC-PLC，经10μg／ml D609处理后，两种PC-PLC的活性均显著下降（P＜0.01）。4．2利用荧光探针DCHF来检测细胞内ROS水平发现，当骨髓间充质干细胞被诱导分化为神经元时，ROS的水平显著升高（P＜0.05）；对NADPH氧化酶的活性检测发现分化过程中，NADPH氧化酶的活性升高3倍左右（P＜0.01）；对SOD的活性检测发现分化过程中，Cu／ZnSOD和MnSOD的活性并没有明显的变化（P＞0.05）。4．3免疫细胞化学检测发现，当骨髓间充质干细胞被诱导分化为神经元时，NF-κB在细胞质上一般均匀分布，并未观察到NF-κB的核移位情况；膜整连蛋白B4的水平显著升高（P＜0.01）。Western Blot检测发现分化过程中，c-fos蛋白水平升高（P＜0.05）。免疫细胞化学和Western Blot检测发现分化过程中，Rb蛋白的水平显著升高（P＜0.05）。5．D609对NSC的分化、凋亡诱导5．1从大鼠胚胎的大脑皮层组织中分离培养NSC细胞团。免疫细胞化学方法证实，这些细胞的Nestin蛋白表达呈阳性。利用血清诱导这些细胞分化后，细胞表达神经元的特异性标记物NSE、NF-L和突触素。5．2在24-72 h，5-15μg／mL D609抑制神经干细胞的存活（P＜0.01，P＜0.05），并且抑制效果呈现时间和浓度依赖性；相差显微镜下观察发现，10μg／mL D609处理神经干细胞24 h，神经干细胞团解体，许多细胞膜发泡，形成凋亡小体；吖啶橙染色显示，D609处理的细胞中，细胞核固缩、染色质凝集、凋亡小体清晰可见；TUN-EL染色发现，D609处理的细胞中，TUNEL染色阳性有极显著的升高（P＜0.01）；LDH检测显示，D609 15μg／mL处理神经干细胞72 h，与对照组相比，培养液中LDH酶活力变化不显著（P＞0.05）。5．3使用荧光探针DCHF检测细胞内ROS水平的变化，结果发现10μg／mL D609处理神经干细胞24 h，细胞内的ROS水平显著降低（P＜0.05）。结论：1．D609能诱导rBMSC、hBMSC和hPMSC分化为神经元样细胞。2．FGF-2不但能增强D609对细胞的诱导作用，而且有效地维持分化后细胞的存活。3．这些分化的神经元样细胞具有与体外培养的正常神经元相似的功能特征，即随着处理时间的延长，细胞的线粒体膜电势升高而静息膜电位逐渐下降。4．D609的诱导分化作用是由于其对PC-PLC活性的抑制，PC-PLC可能激活ROS信号通路，NADPH氧化酶、c-Fos包括在此信号通路中；膜整连蛋白β4、Rb蛋白可能参与PC-PLC介导的调控骨髓间充质干细胞分化这一过程；SOD和NF-κB可能与此分化过程无关。5．D609并没有诱导神经干细胞分化，而是诱导细胞凋亡。适当的ROS水平可能对神经干细胞的存活具有重要作用。