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大豆细菌性斑点病是一种在大豆上比较普遍的细菌性病害,可能造成大豆大范围减产,并且在我国大豆主产区东北地区也是一种比较重要的病害。引起该病害的主要病原菌是丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas savastanoi pv.glycinea),本实验室从东北采集到的大豆病叶中分离得到了 2个丁香假单胞菌株分别命名为A1和S1。丁香假单胞菌在致病的过程中Ⅲ型分泌系统及通过该系统分泌的Ⅲ型效应分子是非常关键的致病因子。Ⅲ型效应分子主要包括无毒蛋白、DSP类蛋白和Harpins,在病原菌的致病过程中分别具有不同的作用。为了深入探究丁香假单胞大豆致病变种Ⅲ型效应分子的作用机制,本研究主要包含以下几方面,分别为A1菌株全基因组测序、A1菌株和S1菌株的HrpZ蛋白差异序列功能研究以及A1菌株的Ⅲ型效应分子功能研究。1.为了分析A1菌株的编码基因特性以及明确该菌株的基因组序列,对A1菌株进行全基因组测序并绘制了染色体基因组图谱和内生质粒基因组图谱。该细菌基因组中染色体DNA大小为5755153 bp,GC含量为59.41%,5001个编码基因;内生质粒大小为71352 bp,GC含量为54.05%,85个编码基因。位于染色体上的5001个编码基因中有4004个与已知功能的蛋白编码序列同源,还有部分新的基因功能有待探究。A1菌株的基因组特性如下:非编码RNA主要有sRNA、rRNA及tRNA三种,分别有14、16和63个;共有33个代谢途径;病原与宿主互作数据库比对发现有134个蛋白可以与数据库中的蛋白互作,并且其中的87个蛋白与病原菌毒性有直接关系;有完整的Ⅰ-VⅥ型分泌系统,相关基因个数分别为5、15、55、9、1、30;T3SS分泌的效应分子17个;致病相关毒力因子230个。通过与已知的参考基因组比对发现,在A1菌株的基因组中存在345个特有基因,参与多条代谢途径。针对基因组进行的初步分析为进一步深入研究丁香假单胞菌的Ⅲ型效应分子提供了序列基因,也为致病性的探究奠定基础。2.丁香假单胞大豆致病变种(P.savastanoi pv.glycinea)A1和S1菌株编码产生的HrpZ蛋白差异序列主要集中在C端的3个区域,并且这2个蛋白诱导非寄主HR的能力也存在差异。本研究将探究HrpZ蛋白这3个差异区域在烟草上诱导HR和抑制烟草花叶病毒(TMV)中所起的作用。采用常规PCR及重叠PCR方法将这2个hrpZ基因的3个差异区域分别进行互换,构建了相应的重组表达载体,表达并纯化得到了6个重组蛋白,相对分子质量均在41×103左右。并检测了其诱导HR活性、诱导植物抗病性。检测结果表明,重组蛋白HrpZs(S2→A2)和HrpZA(A3→S3)诱导HR的能力相比亲本都有所增强,6个重组蛋白诱导烟草抗TMV的活性都明显强于亲本,其中,HrpZA(A3→S3)和HrpZS(S3→A3)的活性最强。此试验表明HrpZ蛋白的这些差异区域(第7、8、9个α-螺旋)是过敏反应能力的主要调控区域,同时C-端第8、9个α-螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关。本研究为改造HrpZ类harpin蛋白激发子,提高其诱导抗性及功能域研究提供了理论依据。3.本研究通过全基因组测序及生物信息学分析后,采用常规PCR方法克隆得到hopAA1、hopAE1及hopAH2三个效应基因。生物信息学方法分析这三个效应基因得出,全长分别为1452 bp、2739bp、1248 bp,编码氨基酸数分别为484、913、416;均为胞内蛋白,不含有信号肽。将三个效应基因与双元表达载体PVX连接后转化到农杆菌GV3101中,构建成效应分子的农杆菌瞬时表达菌株。通过瞬时表达技术检测效应分子的生物学功能发现,三个效应分子在本氏烟体内表达24 h后均能促进烟草疫霉的侵染。为了验证这一表型采用RT-PCR法检测效应分子体内24 h后防卫相关基因WRKY、EIN2、NPR1的表达情况,检测结果如下:HopAA1处理烟草24h后转录因子WRKY的表达量明显降低;HopAE1处理烟草24 h后乙烯信号通路的重要基因EIN2出现明显的下调表达;HopAH2处理烟草24 h后EIN2及水杨酸信号通路的重要调控基因NPR1表达量均明显下降。因此,Ⅲ型效应分子A1菌株致病过程中通过干扰烟草体内的免疫防卫反应发挥作用,这一发现为研究Ⅲ型效应分子与寄主靶标的互作奠定基础。