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叶绿体不仅是植物光合作用的关键器官,也是氨基酸合成的重要场所。叶色突变体是植物光合作用、光形态建成、叶绿素生物合成、激素合成等植物生理学研究中的重要材料,而且在叶绿体结构、功能、遗传、分化与发育等基因功能研究方面也起着不可替代的作用。除此之外,在水稻杂交制种过程中,叶色变异还可作为标记性状应用于杂交种子纯度的鉴定及田间去杂等。因此,发掘和鉴定水稻叶色突变体,开展叶色基因的克隆及其作用机理方面的研究,具有重要的理论意义和应用价值。本研究以2个水稻叶色突变体为材料,即白化转绿突变体gral (gfeen-revertible albino 1, gral)和黄化转绿突变体grcl (green-revertible chlorina 1, grcl),从表型、生理、细胞、遗传和基因功能方面开展了研究,为进一步阐明叶绿素合成调控和叶绿体发育的分子机制奠定了基础,并为水稻叶色标记的开发提供了材料。主要研究结果如下：1.水稻白化转绿基因GRAl的研究：(1)水稻白化转绿突变体gral来源于籼稻9311的60Co辐射诱变后代,叶片白化表型主要表现在第1、2片叶,在播种4周后恢复正常绿色。透射电镜观察表明,突变体gral白化叶片叶绿体数目减少,类囊体排列疏松,嗜锇体数目较多。进一步测定野生型9311和突变体gral的农艺性状则表明,突变体gral的株高、分蘖数、穗长、结实率、千粒重与野生型差异不显著。分别设定了20、24、28、30、32、36-C 6个温度对野生型和突变体gral进行了温敏实验,结果表明,在20、24、28℃条件下,突变体gral叶绿素a和b的含量都显著低于野生型；而在30、32、36-C条件下,突变体gral叶绿素a和b的含量与野生型差异不显著。因此,突变体gral是一个低温表达型的叶色突变体。(2)利用图位克隆的方法克隆了GRAl基因(Os03g0255200),转基因互补实验证明Os03g0255200即为目的基因。GRAl基因编码了一个未知功能的DUF3353家族蛋白。蛋白结构域分析表明,GRAl蛋白由N端转运肽、DnaJ结构域和4个跨膜结构域组成。DnaJ结构域往往与Hsp70蛋白互作参与蛋白的折叠和转运,为了验证GRAl蛋白DnaJ结构域的功能,对GRAl蛋白和叶绿体定位的Hsp70-7和Hsp70-8蛋白进行了酵母双杂交实验。结果表明,GRAl蛋白并不能和叶绿体定位的Hsp70-7和Hsp70-8互作,这说明GRAl蛋白结构预测的DnaJ结构域是一个非典型的DnaJ结构域。(3)为了研究GRA1基因在水稻各组织中的表达模式,我们进行了GRAl自身启动子融合GUS报告基因的组织染色和不同组织的quantitative Real-time PCR分析(qRT-PCR).结果表明,GRAl基因在根、茎、叶、穗中都有表达,但主要在叶中表达,尤其是幼叶中。对GRAl蛋白的亚细胞定位实验表明,GRAl蛋白定位在叶绿体中,与其功能一致。分别在20℃和30-C条件下,对野生型和突变体叶绿素合成相关基因进行了qRT-PCR分析。在20℃条件下,11个叶绿素合成相关基因在突变体中的表达全部下调；在30-C条件下,HEMA、HEME2、CRD1和DVR基因在突变体中表达明显上调,而其它基因表达未发生明显改变。因此,GRA1基因突变影响了叶绿素合成基因的表达。(4)分子进化树分析表明,GRAl蛋白在水稻中有2个同源基因,其中一个同源基因为水稻黄化转绿基因YLCl。为了研究GRA1和YLCl基因之间的关系,构建了gral/ylc1双突变体。双突变体在24℃和30℃2个不同的温度条件下,都表现为叶片完全白化,而且在2叶1心期死亡。叶片叶绿素含量的测定表明,双突变体叶绿素含量基本为零,这说明双突变体不能正常合成叶绿素。透射电镜观察表明,双突变体叶片细胞中叶绿体数目极少,而且叶绿体内都有较大的空泡。因此,双突变体是由于叶绿体无法正常发育而致死。综合看来,GRA1和YLCl基因对于叶绿体的发育是必需的。2.水稻黄化转绿基因GRCl的研究：(1)水稻黄化转绿突变体grcl来源于籼稻中9B的60Co辐射诱变后代,各种农艺性状都已稳定。突变体grcl的黄化叶主要出现在4叶期以前,4叶期以后逐步开始转绿,抽穗前恢复为正常绿色。突变体grcl的叶绿素、类胡罗卜素以及叶绿素前体物质的含量都显著低于其野生型中9B。透身电镜观察表明,突变体grcl黄化叶片类囊体排列疏松,嗜锇体增多。同时,突变体grcl的农艺性状包括株高、分蘖数和穗长都显著低于野生型,并伴随着早抽穗表型。因此,GRCl基因的突变不仅影响了叶绿素的合成和叶绿体的发育,同时也影响了植株的生长发育。(2)利用图位克隆的方法克隆了GRCl基因,该基因编码一个血红素加氧酶1(Heme Oxygenase1, HO1)。qRT-PCR分析表明,HO1基因在突变体中表达下调,而11个叶绿素合成相关的基因表达则上调。前人研究表明,HO1基因突变体会影响到植株的抗氧化能力。因此,采用0.5 M的甲基紫精(MV)对野生型和突变体grcl处理8小时后,用qRT-PCR分析了SodAl和CatA基因的表达水平。结果表明,相比于野生型,这2个基因的表达水平在突变体中明显减少,与前人研究一致。这说明,HO1基因即为GRa基因。亚细胞定位结果表明GRCl蛋白定位在叶绿体中,与该基因的功能一致。因此,GRCl基因对于叶绿体的发育和叶绿素的合成都具有重要作用。