背景年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration, AMD)是发达国家55岁以上人群视力损害和致盲的首要病因1。在我国,随着人口的老龄化和卫生保健水平的不断提高,AMD的发病率也越来越高。根据临床表现的不同,AMD分为萎缩型,(又称干性或非渗出性)和渗出型(又称湿性或盘状黄斑变性)两类。其中对视力危害最大的是湿性AMD患者,常常因黄斑部多发性视网膜色素上皮脱离(Retinal Pigment Epithelium Detachment、脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization,CNV)致视网膜下出血或出血性视网膜脱离或玻璃体积血,最终演变为后极部广泛的瘢痕形成,使黄斑中心凹的视功能丧失殆尽2。因此科研人员一直在努力探索新的技术试图终止或逆转这种视力丧失,这些技术包括光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)3、放疗4、黄斑转位5和药物治疗。PDT相对于激光光凝最主要的优势在于：可以用于黄斑下CNV的治疗；不损害神经视网膜和脉络膜而选择性地阻塞病理状态的新生血管,避免暗点的形成。尽管PDT为临床治疗AMD带来了希望,但是仍存在一些问题,限制了其广泛应用：首先其适应症范围狭窄,TAP研究6表明PDT对于典型性CNV占病变50%以上的CNV和隐匿性CNV有效,但仅有14%的患者治疗后两年内视力有提高7；其次,CNV复发率高,一般每隔3个月就需要重复治疗一次7；第三,PDT治疗后也可能导致视网膜脱离等严重并发症8；第四,该疗法费用昂贵,患者的经济压力巨大。药物治疗主要包括干扰素9、thalidomide10、曲安奈德11和抗血管内皮细胞生长因子(Vascular Epithelial Growth Factor, VEGF)12,13。目前多项研究证实抑制血管内皮生长因子(VEGF)作用的药物有着比较乐观的前景：Krzystolik等14在灵长类动物实验中证实Ranibizumab可以降低CNV的发生率且减少病灶的渗漏。近来有报道超过35%的经典型CNV的湿性AMD患者在使用Ranibizumab治疗,年内视力明显提高15,16,未来有可能通过玻璃体腔持续不断的给药,提高药物治疗的有效性。目前认为抗VEGF制剂(包括抗VEGF抗体及因子)是治疗湿性AMD的主要方法,主要是通过阻断VEGF作用于血管内皮细胞的生物活动来达到治疗湿性AMD的目的,这些生物活动包括视网膜下间隙新生血管复合物形成过程中活跃的有丝分裂和血管通透性增加17。但是抗VEGF制剂治疗湿性AMD仍具有局限性,表现在如下几个方面：第一,抗VEGF制剂只能阻止未完全发育的新生血管管壁的渗漏,而对于AMD患者已经形成的视网膜下新生血管膜则无效；第二,新生血管的形成还涉及其它信号通道的参与,是一个多因素的调控事件,因此仅仅阻断多个调控因子之一的VEGF细胞内信号可能并不能完全抑制新生血管的生成18；第三,抗VEGF制剂的全身吸收同时也扰乱了生理状态下的血管形成,尤其是影响了心肌梗死后冠状动脉侧枝循环的建立与恢复以及伤口的愈合19；第四,抗VEGF制剂需要反复、多次玻璃体腔注射,这些操作本身增加了发生视网膜脱离和眼内炎的风险12。由于上述不利因素的存在,仍有必要探索治疗AMD的其它可行办法。要想找到一种有效治疗AMD的方法,首先就要弄清楚AMD的病理发生机制。视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium, RPE)在AMD的病理发生上占据了重要位置。RPE由排列规则的六角形色素上皮细胞单层组成,构成了视网膜的外屏障。RPE细胞顶部的细胞外基质称为视网膜下间隙,由光感受器间的基质(interphotoreceptor matrix,IPM)20,21充填。正常生理状态下,RPE细胞的微绒毛朝向视网膜下间隙,通过IPM与光感受器紧密连接。顶部的细胞膜发出微绒毛,形成致密的网状组织,光感受器外节插入其间,形成两层广泛的接触。基底部的细胞膜向细胞质内陷,形成许多折叠,附着在Bruch膜(Bruch’s membrane, BM)上。Bruch膜是一个五层结构,厚约1-4um,是连接RPE基底膜和脉络膜毛细血管的重要结构。此外RPE细胞可以分泌抑制血管生成的色素上皮源性因子(Pigment Epithelial-Derived Factor PEDF)23、血管上皮生长因子(Vascular Epithelial Growth Factor VEGF)24以及细胞外基质。目前认为AMD患者CNV可能与RPE细胞分泌VEGF和PEDF比率失调有关RPE是光感受器进行新陈代谢所需物质的重要传递途径。RPE的结构和功能对维持正常视网膜结构和功能起着至关重要的意义。在人衰老的过程中,氧张力增加可导致RPE和脉络膜毛细血管损伤,进而引发Bruch膜和脉络膜慢性炎症反应。RPE和脉络膜毛细血管损伤和炎症可导致异常细胞外基质的形成,这些异常细胞外基质可改变供给视网膜和RPE的营养物质的转运,可能会促成RPE和视网膜的进一步损害26,如视网膜、RPE和脉络膜毛细血管的萎缩以及CNV的长入。这些衰老体征最终促进了AMD的病理学发生27。AMD在病理发生学上主要分为早期和晚期2种类型。早期AMD以玻璃膜疣(drusen)的形成和RPE异常为特征。晚期AMD包括两种临床类型28：萎缩型/干性型和渗出型／湿性,后者主要以脉络膜新生血管形成,跨过受损的Bruch膜长入上皮下和或视网膜下区域’导致RPE细胞的成片丢失和RPE-光感受器之间的屏障破坏为特征30。无论哪一种类型的AMD,导致AMD患者视力丧失的主要原因都是RPE片状丢失和视网膜下纤维血管长入,破坏了RPE与光感受器之间的屏障,导致与RPE紧密相连的光感受器细胞的丢失和凋亡。近年来,随着对AMD发病的分子和细胞机制的进一步了解,有人提出了利用健康RPE移植治疗AMD的概念32。基于RPE的潜在调节功能以及对疾病过程的调控,理论上认为RPE移植不仅可以恢复视网膜正常的解剖功能、重建光感受器和脉络膜毛细血管之间的代谢屏障,还能提供光感受器所需的支持功能。基于此,很多学者先后开展了人RPE移植的研究。早期人RPE移植的研究多是同种异体移植,受体移植排斥反应导致移植后视功能恢复不明显35-37。后期虽然开展了自体RPE细胞移植,但效果不尽如人意。究其原因,大多数研究均采用RPE细胞悬液或RPE移植片进行视网膜下移植38-44,移植后这些细胞悬液或植片不能正常地贴附在病变的Bruch膜上,以孤立的细胞团的方式存活,不能在黄斑中心凹下形成单层上皮细胞层；即使细胞能够重新贴附,其分化的功能也明显受到限制47,48。而RPE细胞只有保持正常的细胞极性才得以发挥生理功能,杂乱无章分布的RPE细胞无法重建功能。有研究表明在RPE移植的过程中供体健康RPE细胞很难附着在受体病变的Bruch膜上,而供体RPE细胞移植后必须重新附着在受体基质上以避免凋亡49。供细胞贴附的Bruch膜的质量和数量直接决定了种植的人胚胎RPE细胞的命运。生理状态下,RPE细胞自然贴附于Bruch膜,后者构成了RPE细胞的基底膜。许多移植研究把这一层视为移植RPE细胞重新附着的支架6。Bruch膜厚约1-4um,主要有分为5层：视网膜色素上皮基底膜；内胶原层；弹力层；外胶原层和脉络膜毛细血管基底膜。Bruch膜由Ⅰ型和Ⅳ型胶原；粘连蛋白；纤维连接蛋白和弹性蛋白构成,支持RPE细胞的贴附、视网膜营养物质和代谢产物的转运。Bruch膜的年龄和类型显著影响移植细胞的重新附着。贴附在Bruch膜基底层(尤其是年轻供体)可以使RPE细胞的存活率,增殖率和融合能力较贴附Bruch膜其它层高。有研究发现Bruch膜的内层胶原层的老化改变会抑制附着于Bruch膜的RPE细胞重新增殖。此外老化的黄斑下Bruch膜并不支持移植RPE细胞的生存和分化45-46。未经治疗的老化黄斑下Bruch膜也不支持人胚胎RPE细胞的生存和分化,但经过适当治疗后,Bruch膜却可以在器官培养研究中支持移植RPE的生存和分化33。大量研究发现51-56, RPE细胞在健康的膜性基质上生长能够形成单细胞层,保持完整的生物学特征。基于上述发现,人们认识到重建Bruch膜,恢复视网膜下间隙的解剖和功能是视网膜RPE移植首要解决的关键问题之一57。如果通过重建受体Bruch膜,使移植的健康RPE细胞在重建的Bruch膜上正常生长、分化,就可能移植恢复视网膜正常的解剖功能、重建光感受器和脉络膜毛细血管之间的代谢屏障,恢复位于RPE上方的光感受器的视觉功能。为此许多实验室先后研究了各种生物的或合成的Bruch膜支架,试图模仿Bruch膜的功能,提高RPE移植的成功率。到目前为止,合成高分子化合物如交联胶原58、明胶59、纤维蛋白原60、生物组织如Descement膜55、晶状体前囊61-63和羊膜64-65已经被尝试用作RPE移植中的Bruch膜替代物的研究。首先RPE细胞在这些基质上生长、分化形成上皮细胞单层,然后再进行RPE单层细胞—Bruch膜性替代物的移植。但至今这些Bruch膜替代物均存在不同程度的缺陷,难以应用于临床,如交联胶原由于厚度、穿透性差、不易降解等因素在移植过程中容易损伤视网膜66；明胶则不能为供体RPE细胞提供一个理想的附着面,难以保证移植细胞在受体病变或缺失的Bruch膜上存活59；以纤维蛋白原60为基质载体的移植RPE细胞在视网膜下间隙以多个散在的细胞片形式存在,难以维持细胞的极性,同样不是理想的基质膜的选择。尽管从患者身上直接获取的晶状体前囊和Descement膜,可以避免移植排斥反应的发生,但手术操作可能带来创伤以及移植步骤繁琐的问题63,因此亦不是理想的Bruch膜替代物。从上述Bruch膜替代物研究发现,要使RPE移植成功,移植RPE细胞必须重新贴附在结构特性与Bruch膜相类似的物质上，才能维持正常的RPE细胞极性,并且能够在视网膜下间隙准确定位33。作为Bruch膜的替代物,首先应该在厚度、渗透性、生物相容性方面与Bruch膜相似,并有助于细胞贴附。此外,还应该有助于维持RPE上皮的特征,即功能性紧密连接、顶部微绒毛、光感受器外节层的吞噬作用和规则的上皮单层。组织工程学技术的广泛应用为RPE移植带来了新的希望。作为RPE细胞生长的基质膜,可生物降解并具有生物相容性的聚酯聚合物女(?)PLLA矛(?)PLGA(主要由聚酯纤维Polyester组成)67可以有效地支持RPE细胞生长,明显改善体外培养的RPE细胞的生存率和极性,已经得到美国FDA批准使用于临床。但僵硬的聚酯纤维在视网膜下间隙移植时容易损伤视网膜,而且降解过程中有可能产生神经视网膜毒性,在一定程度上限制了聚酯纤维作为理想膜性基质的应用33。近十年来组织工程学纳米技术的应用,再次激发了人类研发类似原位细胞外基质(native extracellular matrix,ECM)的膜性支架的兴趣。原位ECM不仅为细胞提供生理支持,还为细胞贴附、迁徙提供具有特殊腺体的基质,进而通过各种生长因子调控细胞的增殖和功能。原位ECM的一个显著特征是具有纳米级大小的生理结构。胶原纤维和弹性纤维等结构蛋白的纤维直径在几十至几百纳米范围内,纳米级蛋白纤维相互整合形成的筛网为组织提供力量和弹性68。早在19世纪60年代就有纳米级特征影响细胞行为的报道6。20-50nm的蚀刻硅胶纳米级表面可以促进神经细胞贴附和羟基化酶的作用70；纳米级表面结构可以促进成骨细胞的粘附71。有报道当纤维直径在60-200nm之间,生长在炭纳米纤维上的成骨细胞粘附、增殖和碱性磷酸酶的活动均有增强,而其它种类的细胞如成纤维细胞,软骨细胞和肌细胞的贴附并不受影响。提示：纳米级表面特征促进粘附蛋白的形成,进而影响细胞行为。基底膜是一种非常重要的ECM,厚约40-120nm,是所有上皮和内皮细胞生存的基础。Bruch膜作为眼内的一种基底膜,在维持RPE的正常功能方面发挥着重要功能。Bruch膜纤维主要由Ⅳ型胶原和粘蛋白纳米纤维组成,膜上的纤维、微孔等均以纳米级大小存在。作为理想的膜性支架,其结构和生物学功能应尽可能与原位ECM类似,即化学组成和生理学结构一致。微孔纳米纤维膜(Electrospun nanofibers, EPN)由于表面结构与人体基底膜相似,是目前最具有发展前途的一种生物学材料。基于上述研究,我们推测EPN可能可以充当Bruch膜的理想替代物,促进RPE细胞正常生长、分化,为RPE移植治疗湿性AMD患者带来新的曙光。尽管人们对聚酯膜(Polyester)作为移植中RPE细胞生长支架的研究有一定认识,近年来蚀刻多空技术的出现可能会进一步改善聚酯膜作为RPE细胞生长支架的性能,据我们所知,目前尚未见相关报道,本课题将通过EPN与蚀刻多空聚酯膜(Etched pore polyester, PET)两种生物材料的对比研究,进一步明确二者的优缺点及未来作为RPE移植中Bruch膜理想替代物的可能,为RPE移植成功治疗AMD带来新的希望。本研究分为三个部分：第一部分：人胚胎RPE细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜和多空聚酯膜上的生长研究比较。应用倒置荧光显微镜、免疫荧光染色和Western Blot法比较研究人胚胎RPE细胞在EPN和PET两种潜在的Bruch膜替代物上的生长、分化情况；借助扫描电镜比较两种替代物与在体Bruch膜的纤维排列的异同,为理想Bruch膜替代物的研究提供初步理论基础。第二部分：成人RPE细胞在微孔聚酰胺纳米纤维膜和多空聚酯膜上的生长研究比较。建立成人RPE细胞培养的方法,采用第一部分的方法,进一步比较上述两种材料作为理想Bruch膜替代物的可能性。第三部分：两种Bruch膜替代物植入P21RCS大鼠视网膜下间隙的组织学观察。通过玻璃体切割手术分别把EPN和PET植入视网膜下间隙,通过组织切片初步观察两种替代物植入视网膜下间隙的生物相容性。结果：1.EPN在超微结构上与在体Bruch膜类似；2.EPN和PET均支持体外培养的人胚胎RPE细胞的生长和分化,转换钙离子浓度可以促进RPE细胞在上述两种Bruch膜替代物上的分化。免疫荧光染色以及Western Blot均证实上述两种替代物上的RPE细胞能够正常分化；3.尽管EPN支持人胚胎RPE细胞的贴壁生长、分化,但在常规培养第10天开始出现部分RPE细胞单层变薄,尤其是EPN游离面上的RPE细胞单层不均一,呈网格状改变；培养第15天,EPN游离面和塑料附着面均出现不同程度的RPE细胞脱落,膜表面暴露或破裂；而PET上培养的人胚胎RPE细胞单层虽然不规则,但能够完整地附着在膜表面；4.通过高密度种植、转换培养基钙离子浓度,可以成功培养老年人RPE细胞,细胞形态与人胚胎RPE细胞类似；5.高密度种植条件下,EPN上的成人RPE细胞生长分化优于PET上的成人RPE细胞；6.作为Bruch膜的理想替代物,除了具备纤维排列与Bruch膜内胶原层相类似、具有纳米级表面特征及渗透性特点外,大而平滑的表面可能更有利于RPE细胞单层的维持；7.P21RCS大鼠视网膜下间隙植入物的初步组织学研究提示EPN和PET在视网膜下间隙均具有生物相容性。结论：1.EPN由于结构与Bruch膜相似,是一种具有发展前景的Bruch膜替代物；2.EPN的游离面不能支持人胚胎RPE细胞单层的长期维持,可能与膜表面的形态差异有关,但EPN的塑料附着面可以弥补这一缺陷。另一方面,成人(老年人)RPE细胞在EPN上的有效分化为EPN作为理想Bruch膜替代物的进一步研究提供了保障；3.对于RPE移植成功治疗AMD,Bruch膜替代物的研发可能发挥了重要的桥梁作用。