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研究目的及内容：肿瘤组织中有一种在数量上占少数的干细胞样细胞,它具有无限的增殖能力和分化潜能,是肿瘤形成的起始细胞(CSCs)。CD24低表达或阴性表达细胞群被认为属于乳腺CSCs,乳腺CSCs与上皮间质转换(EMT)之间存在着一定的联系。AURKA是一种癌基因,通过多种途径参与肿瘤的发生、发展。AURKA蛋白也是一种中心体相关激酶,过表达导致中心体扩增、纺锤体形成异常和基因组不稳定性,在肿瘤的转移过程中起重要作用。肿瘤细胞中只有少数CSCs决定肿瘤的侵袭、转移和播散,因此AURKA和CSCs均与肿瘤的转移有关,但AURKA与乳腺CSCs、EMT的关系及导致乳腺癌远处转移和浸润的机制目前国内外尚未见报告。方法：建立裸鼠移植瘤模型,将2X106细胞注射到4周龄非卵巢切除的雌性NCR/Nu/Nu裸鼠侧腹部皮下。IVS影像系统用来检测肿瘤的定位和生长。数显游标卡尺每星期用来测量肿瘤体积。12周后处死裸鼠,建立原代培养细胞和给予不同的处理。肿瘤在裸鼠体内生长8周后通过尾静脉注射的方法给予shRNA AURKA慢病毒转导粒子,一周2次,连续4周。采用MCF-7、MCF-7 1GX、MCF-7RAF-1、MCF-7RAF-1 1GX、shRNA MCF-7RAF-1 1GX细胞系进行免疫荧光单标记和双标记实验和Western blotting实验检测中心体表型、EMT表型、AURKA蛋白、Smad家族蛋白、THBS1、PCDH8和激素受体的表达。采用流式细胞术荧光染料碘化丙啶进行细胞周期分析,ModFit软件分析所得数据。采用流式细胞术直接免疫荧光标记法分析CD24的表型及阳性细胞和阴性细胞的分选。TRIzol法提取细胞总RNA,采用Affymetrix基因芯片技术分析基因转录组谱。结果1与MCF-7细胞相比较,MCF-7RAF-1细胞呈梭形,MAPK信号通路活化,但其中心体表型检测、EMT和CD24表型均无显著改变。传统化疗药正定霉素(DR)处理可使其细胞周期检查点蛋白上调。雌二醇处理后,34%的MCF-7RAF-1细胞进入细胞复制周期,明显少于MCF-7细胞(58%)。同时给予雌二醇和三苯氧胺处理,MCF-7细胞S期细胞百分数由58%下降到了15%,而MCF-7RAF-1细胞则由34%下降到24%。2 MCF-7RAF-1裸鼠异种移植瘤显示了明显高于MCF-7肿瘤的生长速度,原发瘤组织呈现组织学更高级别的肿瘤及中心体扩增的表型,激素受体检测ERa(+),但PR (-), HER2/neu (+),接种瘤的裸鼠肺组织中出现了转移。MCF-7RAF-1原发瘤原代培养产生的MCF-7RAF-1细胞中，AURKA蛋白出现了显著的高表达,同时细胞周期检查点蛋白Cyclins如D1、E和A并未显示高表达,但Cyclin B、CDC25A和Claspin则显示了高表达。基因芯片分析显示了MCF-7RAF-1中MAPK信号通路和TGFB/smad信号通路中的相关因子的表达出现异常。3 MCF-7RAF-1 1GX的CD24阴性细胞所占百分比为34%,显著高于其来源的母系细胞系。CD24阴性细胞群中心体表型出现了扩增,AURKA出现了过表达,发展了EMT特征,Wnt6、Smad家族、THBS1、PCDH8表达出现了异常,ERa表达下降而HER-2表达增加。4 AURKA抑制剂能够使细胞周期阻滞于G2／M期,显著降低AURKA蛋白的表达。重要的是,AURKA抑制剂MLN8237只在MCF-7RAF-1 1GX细胞系诱导了细胞凋亡标记物cleaved PARP的表达。同时CD24阳性细胞百分率增加,由对照组的60%增加到85%(处理48小时)和94%(处理72小时)。5给予CD24阴性细胞群AURKA抑制剂也能够诱导细胞凋亡,但DR不能诱导其发生凋亡,此外AURKA还可使CD24阴性细胞群上皮标记物E-cadherin、B-catenin重新获得表达,而间质标记物vimentin表达显著下降,smad家族蛋白表达下调,THBS1和PCDH8表达恢复。shRNA AURKA处理的裸鼠显示了明显的肿瘤体积缩小,AURKA蛋白表达下降,中心体扩增的表型受到抑制,未发生远处转移。shRNA MCF-7RAF-1 1GX细胞CD24阴性表达率只有15.4%,EMT表型、smad家族、THBS1、PCDH8表达出现逆转。结论RAF-1基因转染导致的MAPK信号通路活化经过裸鼠模型体内的生长使AURKA基因转录增加从而使蛋白过表达。乳腺癌细胞对AURKA存在“癌基因嗜性”,AURKA高表达细胞显示了中心体的扩增,并经过体内生长发展了分化更差、组织学分级更高的肿瘤。MCF-7RAF-1经过裸鼠模型体内的生长诱发了多条信号通路和蛋白表达的异常,其中Wnt信号通路、Smad家族、THBS1蛋白和PCDH8蛋白的异常与AURKA高表达有关。AURKA可驱动CD24阴性细胞群的发展,即乳腺癌干细胞数量的增加,而且还诱导了EMT的发生并引起乳腺癌细胞的远处转移。抑制AURKA蛋白的表达可逆转乳腺癌细胞CD24阴性细胞群的表型、EMT表型特征和smad家族蛋白、THBS1、PCDH8的表达。因此AURKA在乳腺癌干细胞自我更新和维持中及EMT表型的发展中起重要作用,针对癌基因AURKA的分子靶向治疗可有助于杀灭乳腺癌干细胞,抑制乳腺癌的增殖、侵袭和转移。