论文部分内容阅读
研究目的:牙髓组织具有感觉、防御、营养、修复和再生等能力,目前治疗牙髓不可逆损伤的经典方法是根管治疗。但是根管治疗会导致牙髓功能的丧失,并且由于根管治疗后的牙齿缺少营养,易发生折裂。当前基于组织工程的牙髓再生策略代替根管治疗成为研究热点,并且取得了很多进展。其中组织工程牙髓的血管化对牙髓再生至关重要,许多研究通过生物材料和细胞因子等方式提高再生牙髓的血管化。然而,当前实现全长根管内牙髓样组织再生依旧存在困难。环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids,EETs）由细胞色素P450催化花生四烯酸产生,最近已有研究表明EETs可以通过改善组织微循环促进组织再生。本课题组通过使用可溶性环氧化物水解酶抑制剂（soluble epoxide hydrolase inhibitor,sEHi）1-trifluoromethoxyphenyl-3-（1-propionylpiperidin-4-yl）urea（TPPU）抑制EETs分解,提高内源性EETs水平来研究TPPU改善根管内微循环促进全长根管内牙髓组织再生的能力。研究方法:人牙髓干细胞（DPSCs）培养:选用正畸减数拔牙或者智齿原因拔除的新鲜完整的牙齿,无菌条件下取出牙髓组织,培养DPSCs,并体外扩增,选用3-5代细胞用于实验。全长根管制备:选用正畸减数拔除的新鲜完整的下颌第一前磨牙,制作12mm长度的牙根,制备成根管冠方开口直径3mm,根尖口直径1mm锥形标准牙根管。通过管形成实验和细胞划痕实验研究TPPU对人静脉血管内皮细胞系（HUVECs）管形成和增殖、迁移的影响;建立HUVECs和DPSCs共培养体系,进一步研究共培养体系内TPPU对内皮细胞管形成和迁移的影响以及通过茜素红、碱磷酶染色探究TPPU对DPSCs分化的影响,并通过Q-PCR方法检测单独培养HUVECs和成骨诱导共培养体系内细胞DSPP、DMP-1、ALP、RUNX-2、HIF-1α,TGF-β和VEGF等相关基因的表达水平。体内实验,将DPSCs复合Matrigel基质胶注入标准全长根管内植入裸鼠皮下。实验组DPSCs术前使用TPPU预处理三天后,实验组裸鼠术前7天至术后2W给予TPPU处理,对照组无TPPU处理。术后8W取出移植牙根,4%多聚甲醛固定,10%EDTA脱钙处理,石蜡包埋后切片,进行免疫组织化学染色。比较根管内再生牙髓样组织的长度、成牙本质细胞分化和血管新生情况。研究结果:管形成实验结果表明,使用TPPU处理的HUVECs形成的管的数量,管与管之间的结节大小和管的直径高于对照组（P<0.05）;细胞划痕实验显示TPPU处理的HUVECs在12h、24h后划痕面积小于对照组（P<0.05）。共培养体系研究显示TPPU处理组HUVECs管形成能力也高于对照组,成骨诱导7d后TPPU处理组ALP阳性高于对照组,成骨诱导21d后茜素红染色TPPU处理组形成更多的钙结节;Q-PCR结果显示TPPU处理组DSPP、DMP-1、ALP、RUNX-2、HIF-1α、TGF-β和VEGF等相关基因的表达水平高于对照组。体内实验:8W后取出移植牙根,免疫组织化学染色显示TPPU处理组相对于对照组,形成更多牙髓样组织和毛细血管,可见更多的牙本质唾液涎蛋白（DSPP）和牙本质基质酸性磷蛋白-1（DMP-1）阳性细胞。结论:TPPU可以促进血管内皮细胞血管形成和血管内皮细胞迁移;共培养体系TPPU能够促进牙髓干细胞成牙本质和成骨向分化。体内实验表明TPPU可以促进根管内牙髓样组织再生,实验组牙本质管壁见成牙本质细胞聚集并通过HIF-1α通路促进内皮细胞和DPSCs对话促进牙髓样组织形成。TPPU有望作为治疗靶点用于牙髓组织工程研究和临床转化。