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耐药细菌和耐药基因的传播以及耐药细菌生物膜的形成已成为影响全球公共健康的两大重要问题。生物膜作为许多细菌的默认生长方式,广泛应用于供水系统、医疗系统和环境自然水体中。然而,在许多情况下,生物膜的生长严重影响人类健康和环境系统的可持续发展。生物膜可在任何生物和非生物表面形成,对环境、工业和人类健康有害影响。因此,抑制和清除耐药生物膜是非常重要的。另外,据研究,大约95%的水体环境中的细菌是以细菌生物膜的形态出现的,细菌生物膜还释放浮游细菌,对水域产生长期环境污染。因此,去除供水系统中的生物膜尤为重要。由于纳米材料和纳米颗粒的大规模生产和应用,纳米颗粒被释放到水体系中。在对污水处理系统进行紫外线消毒的过程中,细菌会受到亚致死光催化(PC)下的影响。众所周知,某些恶劣的生存环境会促进生物膜的生长。然而,PC刺激是否抑制或意外促进生物膜形成或废水处理中更复杂的条件尚不清楚。此外,在实践中,当系统中产生的活性氧浓度较低时,绝大多数细菌通常会逃避致命的攻击,只感到亚致死的氧化压力。这个过程可以定义为亚致死PC,其中一些细菌受到了亚致死活性氧物种(ROSs)的攻击,但仍有大量的细菌生长成膜,这可能会减缓消毒过程中的细菌杀灭过程。因此,需要深入研究亚致死PC刺激细菌生物被膜的生长过程和亚致死PC刺激杀死成熟生物膜的机理,以充分了解它们的响应应激机制。主要研究内容和结论包括:(1)我们首先探究了耐药细菌(Pseudomonas aeruginosa,GEN)在亚致死PC下的生长成膜机理,我们利用酶标仪检测生物膜内的细菌丰度的变化情况发现亚致死PC刺激相较于空白对照组能够降低生物膜内的细菌丰度1-2 log,通过激光共聚焦荧光显微镜观测生物膜厚度的变化情况发现亚致死PC刺激较空白组能够将生物膜生长的厚度降低1/3,利用扫描电镜观测生物膜的形态发现在亚致死PC作用下生长的生物膜的形态被破坏明显,利用冷冻切片机结合激光共聚焦荧光显微镜观测生物膜屏障功能的变化情况发现在亚致死PC作用下生长的生物膜的屏障功能被明显破坏,在亚致死PC刺激培养1天时生物膜的渗透率高达90%,使用相关的生物试剂盒检测了膜内细菌的氧化应激响应与胞外聚合物(EPS)分泌应激响应,发现亚致死PC刺激能使膜内细菌发生强烈的氧化应激响应与EPS分泌应激响应,利用流式细胞仪结合活细胞成像仪检测和酶标仪我们发现在亚致死PC下培养的生物膜内活的不可培养的(VBNC)细菌占比较对照组少。最后,我们使用实时荧光定量PCR仪检测了与生物膜生长、抗生素抗性相关基因、氧化应激和EPS分泌相关基因有关的基因。我们发现,随着EPS分泌量增加,生物膜的屏障作用和厚度也随之增加,这导致了生物膜对亚致死PC刺激的防御作用和基因表达的下调,进而导致氧化应激响应和EPS分泌响应降低。因此,随着培养时间的增加,在亚致死PC刺激下,生物膜的生长和亚致死PC对生物膜的损伤会达到一定的动态平衡状态,最终生物膜将进入缓慢生长状态。揭示了亚致死PC诱导耐药生物膜形成的一系列应激响应机制,揭示了亚致死PC只能在一定程度上抑制抗生素耐药细菌生物膜的生长而不能完全阻止抗生素耐药细菌生物膜生长的现象及发生这一现象的内在原因。这一研究结果为供水循环系统以及污水处理系统中生物膜污染的抑制提供了有效的策略。(2)进一步的,我们继续探究了条件致病菌(Pseudomonas aeruginosa)形成的成熟生物膜在亚致死PC作用下的应激响应机制,进一步探究亚致死PC对成熟生物膜的杀灭效果以及从生物膜内释放出来的细菌与浮游细菌的对比研究。我们利用扫描电镜观测亚致死PC对生物膜形态的破坏,通过流式细胞仪结合活细胞成像仪检测生物膜内细菌的死亡情况,通过激光共聚焦荧光显微镜观测亚致死PC对生物膜屏障功能的破坏情况,通过RTCA多功能实时无标记细胞分析仪检测细菌致病性的变化情况,通过最小抑制浓度(MIC)检测分散出来的细菌的耐药性相比于普通浮游菌的差别,并进一步检测了耐药机制的变化情况。结果表明:在亚致死PC作用下,生物膜内细菌死亡率并不算显著,在亚致死PC作用4 h时,生物膜内细菌的死亡率仅达到13.9%,但生物膜结构坍塌明显,生物膜的屏障功能受损明显,在亚致死PC作用2 h时,生物膜的渗透率就达到了100%,并且生物膜逐渐从生物膜状态向游离状态转化,但并不能完全消除其危害,游离出来的细菌对比普通浮游细菌具有更强的致病性和更强的抗生素耐药性,同时发现这种致病性和耐药性在没有压力刺激的情况下并不能稳定遗传。游离出来的细菌较普通浮游细菌致病性的增加外在表现为对细胞毒性的增加以及对细胞凋亡进程的促进,内在原因是由于细菌自身毒力因子的增加所导致的,而耐药性的增加外在表现为MIC数值的变化,内在原因是由于细菌耐药机制发生了改变对导致的,包括细菌外排泵外排能力的增加以及细菌细胞膜通透性的增加。这部分内容揭示了亚致死PC能够使生物膜从膜状态向浮游状态转化,但并不能完全消除其危害的现象及其本质原因。该研究得到相关结论可以为在生物膜的消除方面提供了一种有效策略及理论支持,对控制和消除生物膜污染具有非常重要的研究意义。综上所述,本研究分别探索了抗生素耐药细菌在亚致死PC刺激下形成生物膜的生长机理以及亚致死PC技术对成熟生物膜的杀灭机制方面的研究。我们发现,在生物膜形成的早期,亚致死PC刺激对细菌形成生物膜的现象只能抑制,但不能完全阻止,并且随着对亚致死PC作用时间的增加,细菌的成膜与亚致死PC刺激带来的损伤将会达到一个动态平衡。而通过亚致死PC刺激造成的氧化胁迫对成熟生物膜的杀灭,则能够将细菌从生物膜状态向一般浮游性细菌状态转化,但却并没有彻底去除生物膜以及生物膜对环境的影响。游离出来的细菌对比普通浮游细菌具有更强的致病性和更强的抗生素耐药性,同时发现这种致病和耐药性均不能在没有压力刺激的情况下稳定遗传。整体而言,本论文的研究可以为以后其相关研究中深入探索生物膜的形成(附着-生长-脱落-分散)以及生物膜对相关刺激所做出的相应的应激策略提供了新的研究思路,同时还为生物膜的去除提供了一种新的研究手段和思路。与此同时,本学位论文还揭示了细菌在亚致死PC下的成膜机制以及成熟生物膜在亚致死PC刺激下的清除、脱落和扩散的一系列应激响应机制,本学位论文得到的相关结论为模拟供水循环系统中细菌成膜的抑制和成熟生物膜的消除提供了有效的调控策略。对未来研究生物膜的清除和控制意义重大。