骨关节炎(osteoarthritis,OA)是中老年人的常见病和多发病,是一种以关节软骨慢性退行性病变为主要病理特征的关节疾病,是老年人群疼痛和致残的主要原因。关节软骨的基质主要是蛋白多糖(proteoglycan,PG),它是软骨强度、组织弹性及关节润滑的物质基础,可以很好的维持软骨内稳态。PG由多条糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)链附着于一条核心蛋白组成,然后通过交联胶原纤维形成空间网状结构。基质的退变或减少程度,是评价软骨质量的主要指标。传统观点认为,OA主要由机械因素及年龄相关的软骨退变所致,但大样本流行病学研究发现,宫内发育迟缓(intranuterine growth retardation,IUGR)新生儿成年后手、髋等多关节OA易感。提示,OA可能具有发育起源。然而,发育源性OA的病因学复杂,病理生理机制不明,临床早期诊断和防治困难。华通胶间充质干细胞(Wharton’s jelly derived stem cells,WJ-MSCs)是一种相对原始的干细胞,来源广泛,保存了宫内不良环境对胎儿发育所产生的不良影响的印记,可以用于胎源性疾病的早期预警。WJ-MSCs可以定向分化为软骨细胞,在该分化过程中,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)信号通路发挥了关键的调控作用,该通路的活化可以促进其下游的软骨基质表型靶基因(α1 chain oftype Ⅱ collagen,col2α1)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表达。我们前期的研究发现,孕期外源物暴露(prenatal xenobioticexposure,PXE)可以导致IUGR并使胎儿暴露于高浓度母源性糖皮质激素(glucocorticoid,GC)中,进而软骨发育不良,出生后OA易感。但是IUGR新生儿来源的WJ-MSCs是否软骨定向分化不良?分化所得的软骨细胞经炎症诱导后是否易出现OA样退变表型?外源物暴露是如何影响软骨分化的?TGFβ信号通路在其中的作用如何,目前均不清楚。基于此,本研究首先提取正常新生儿来源WJ-MSCs,建立成熟的WJ-MSCs提取和培养技术,然后用不同浓度的外源物处理WJ-MSCs,探讨外源物对WJ-MSCs中软骨表型基因表达的影响及其上游相关通路的影响;之后提取正常及IUGR来源的WJ-MSCs,并检测其增殖和分化模型上WJ-MSCs中软骨表型基因表达的差异及其上游相关通路的差异,进一步通过白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)进行诱导,明确宫内不良环境在WJ-MSCs上的印记作用及其对软骨定向分化的影响;在此基础上,我们用不同浓度的皮质醇干预正常来源的WJ-MSCs的定向分化过程,并检测其增殖和分化模型上WJ-MSCs中软骨表型基因表达的影响及其上游相关通路的影响,进一步通过IL-1β进行诱导,明确皮质醇过暴露对WJ-MSCs软骨定向分化后软骨质量的影响。在此基础上探讨TGFβ受体(TGFβ receptors,TGFβRs)作为胎源性OA早期预警标志物的可能性。该科学问题的阐明,有助于加深对胎源性OA发病机制的理解,明确TGFβRs在软骨基质合成中的作用,并进一步明确其作为胎源性OA预警标志物的可能性,为胎源性OA的早期预警奠定理论和实验基础。第一部分外源物对人WJ-MSCs软骨发育相关基因的抑制作用及可能机制目的:本实验室前期研究发现,孕期外源物暴露(prenatal xenobiotic exposure,PXE)所致大鼠IUGR(intrauterine growth retardation)模型上,软骨发育不良及成年后OA(osteoarthritis)易感,同时发现母源性糖皮质激素(glucocorticoid,GC)过暴露是其共性现象。人的华通胶间充质干细胞(wharton’sjelly derived stem cells,WJ-MSCs)是相对原始的干细胞,能提供出生体重与成年疾病长期效应关系的信息。为此,本研究建立人WJ-MSCs增殖模型,探讨多种外源暴露物(包括咖啡因、尼古丁、乙醇)对软骨分化标志基因(Col2α1 和 aggrecan)的影响,并从 GC 屏障 Egr-1(early growth response protein1)和 11β-HSD2(11β-hydroxysteroiddehydrogenasetypes2)和转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)信号通路探讨其发生机制。方法:原代WJ-MSCs的分离、鉴定。取第4代细胞,分别给予用DMEM/F12 1:1培养基配制的常用外源物咖啡因(终浓度分别为0、0.1、1.0、10、100μM)、尼古丁(终浓度分别为0、0.1、1.0、10、100μM)和乙醇(终浓度分别为0、15、30、60mM),以上浓度均基于本实验室前期IUGR大鼠造模检测到的血液浓度换算而来。连续处理5天,隔天更换新鲜的培养液。正常对照组给予等体积培养基。MTS检测细胞存活状况,RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)检测 GC 屏障相关基因、TGFβ(transforming growth factor β)信号通路及软骨表型基因的表达。结果:流式细胞术检测发现,WJ-MSCs培养至4代时,已经较为纯化。不同浓度各种外源物处理WJ-MSCs 5天后,MTS法细胞代谢活力检测结果显示,本实验中所采用的三种外源物的不同浓度处理WJ-MSCs后,细胞的活力与对照组相比没有明显改变。RT-qPCR结果提示:高浓度的各种外源物均可以明显降低软骨表型基因Co12α·(collagen type Ⅱ alpha 1 chain)和 aggrecan 的表达(P<0.01);各种外源物的最高浓度处理后,TGFβ信号通路的关键基因TGFβRⅡ/Ⅰ的表达均降低(P<0.01);高浓度外源物处理 WJ-MSCs 后,GC 屏障相关基因 Egr-1(early growth response protein 1)表达增加(P<0.01),11β-HSD2(11 β-hydroxysteroid dehydrogenase types 2)表达降低(P<0.01)。结论:本研究建立了稳定的人WJ-MSCs提取和体外培养体系。首次在人WJ-MSCs增殖模型上,证实多种外源暴露物(包括咖啡因、尼古丁、乙醇)对WJ-MSCs软骨标志基因(Col2α1和aggrecan)和GC屏障的抑制作用,推测宫内时期暴露的外源物可直接或间接通过损伤GC屏障导致局部组织的高GC暴露,进而通过抑制TGF β信号通路,导致软骨表型基因的降低。第二部分IUGR新生儿来源的人WJ-MSCs软骨定向分化潜能降低及潜在机制目的:流行病学研究发现出生体重与成年骨关节炎相关,第一部分的研究发现人WJ-MSCs增殖模型上,多种外源暴露物(包括咖啡因、尼古丁、乙醇)可以抑制软骨分化标志基因(Col2α1和aggrecan)、损伤GC屏障以及抑制TGFβ信号通路关键基因的表达,提示因宫内不良环境导致的宫内发育迟缓(IUGR)新生儿来源的WJ-MSCs可能存在软骨定向分化潜能降低。本研究拟首先在人WJ-MSCs软骨三维定向分化模型上探讨其软骨分化潜能;进一步在人IUGR来源的WJ-MSCs增殖模型上探讨GC屏障关键基因和软骨分化基因的表达变化,探讨其初步发生机制。方法:按照实验室已经建立的WJ-MSCs提取方法,分别提取正常新生儿及IUGR新生儿来源的原代WJ-MSCs,分别传代至第4代后,建立增殖和软骨细胞三维定向分化模型。在增殖模型上,均以普通培养基培养5天后,检测正常及IUGR来源的WJ-MSCs软骨细胞表型基因、TGFβ信号通路及GC屏障相关基因的表达。在海藻酸钠(sodium alginate)微球软骨细胞三维分化模型上,以相同的分化培养基分化21天,取部分微球固定,进行蕃红O(safranineO)和阿利新蓝(alcianblue)特殊染色分析;部分微球被溶解用于提取总RNA,RT-qPCR检测软骨细胞表型基因和TGFβ信号通路相关基因表达;其余的微球加入IL-1β处理24h进行OA造模,造模后的微球取部分用于进行蕃红O和阿利新蓝特殊染色分析,然后将另一部分微球溶解,RT-qPCR检测软骨细胞表型基因和基质降解相关基因表达。以流式细胞术检测不同来源的WJ-MSCs中阳性表达TGFβRⅡ和TGFβRⅠ的细胞比例。结果:在增殖模型上,与正常组相比,IUGR组软骨表型基因Col2α1(collagen typeⅡ alpha1chain,Col2α1)和aggrecan的表达降低(P<0.01);TGFβ信号通路的关键基因 TGFβRⅡ/Ⅰ 的表达低(P<0.05,P<0.01);Egr-1 表达升高(P<0.01),而 11βp-HSD2表达降低(P<0.01),提示IUGR来源的WJ-MSCs受宫内不良因素暴露已经产生了 GC屏障损伤的印记,且TGFβ信号通路功能。在分化模型上,IUGR组基质合成比正常组少,表现为番红O和阿利新蓝染色浅、细胞数减少以及aggrecan、Col2α1表达降低,其上游的TGFβ信号通路中,TGFβRs的mRNA表达较正常组降低;经IL-1β诱导后,IUGR组软骨细胞OA易感,与正常组比较,表现为番红O和阿利新蓝染色更浅、细胞数更少,aggrecan、Col2α1表达进一步降低,基质金属蛋白酶MMP3、13和ADAMTS5表达升高,提示基质降解增加。流式细胞术检测发现,IUGR来源的WJ-MSCs中,阳性表达TGFβRⅡ和TGFβRⅠ的细胞比例明显低于正常来源的WJ-MSCs。结论:本研究首次在增殖和软骨三维定向分化模型上,证实IUGR患儿来源的人WJ-MSCs的软骨分化不良以及经IL-1β造模后的骨关节炎样退变表型易感,推测,宫内时期IUGR新生儿的WJ-MSCs中GC屏障损伤,导致了局部的GC过暴露,使其TGFβ信号通路抑制,且该抑制效应具有编程效应,最终导致其TGFβRs阳性细胞减少且软骨分化不良。第三部分皮质醇对人WJ-MSCs软骨分化抑制及骨关节炎易感的表遗传调控机制目的:已知宫内不良环境下过暴露的高GC可通过表遗传方式影响基因的持续表达,进而影响组织生长发育。我们前期发现,孕期外源物暴露所致大鼠IUGR模型中均存在母源性GC过暴露共性现象。本课题已在第一部分人WJ-MSCs增殖模型上,证实多种外源物暴露(包括咖啡因、尼古丁、乙醇)所致WJ-MSCs软骨标志基因(Col2α1和aggrecan)降低可能部分来源于GC屏障损伤导致的GC过暴露介导的TGFβ信号通路抑制;且在第二部分证实IUGR患儿来源的人WJ-MSCs细胞GC屏障损伤、软骨分化不良以及经IL-1β造模后的骨关节炎样退变表型易感,以上提示高GC可能通过表遗传印记致使TGFβ低表达,介导了 IUGR来源的WJ-MSs软骨分化不良,但目前机制尚不明确。因此,本研究在建立的WJ-MSCs软骨三维定向分化模型上,证实不同浓度皮质醇对正常来源WJ-MSCs软骨分化及骨关节炎易感的影响,并初步探讨TGFβRs表遗传印记作为胎源性OA早期预测靶标的可能性。方法:取第4代生长状态良好的WJ-MSCs,建立海藻酸钠微球三维软骨细胞定向分化模型,以150、300、600及1200 nM浓度皮质醇处理细胞。在增殖模型上,MTS法检测皮质醇对细胞增殖的影响;现象层面:在分化模型上以不同浓度皮质醇处理WJ-MSCs微球21天,观察形态学改变并检测表型基因和TGFβ信号通路相关基因的表达变化;进一步,给予IL-1β处理24h(OA造模),观察形态学改变并检测软骨表型基因和TGFβ信号通路相关基因的表达变化。机制层面:在三维定向分化模型上以0、300及1200 nM皮质醇联合GR拮抗剂处理细胞7天,检测软骨细胞表型基因、TGFβ信号通路关键基因的蛋白及mRNA表达变化,CHIP-PCR检测TGFβRs及软骨细胞表型基因Col2α1和aggrecan在组蛋白H3K9、H3K14和H3K27的乙酰化改变。结果:不同浓度皮质醇作用WJ-MSCs 5天,MTS法检测显示各浓度皮质醇组细胞代谢活力与对照组相比无明显改变。不同浓度皮质醇处理WJ-MSCs成软骨分化21天和经,番红O和阿利新蓝染色显示病理浓度(600和1200 nM)皮质醇处理组基质合成较生理浓度组(150和300nM)减少;RT-PCR显示病理浓度组Col2α1、aggrecan及其上游的TGFβ3受体Ⅰ和Ⅱ的mRNA表达较生理浓度组显著降低(P<0.01)。进一步经IL-1β诱导后,较生理浓度组(150和300 nM)相比,病理浓度(600和1200 nM)皮质醇组番红O和阿利新蓝染色变浅,表型基因和TGFβ通路的mRNA表达显著降低(P<0.01);但基质金属蛋白酶MMP3、13和ADAMTS5表达呈浓度依赖性升高(P<0.01),提示基质降解增加。同时,与生理浓度皮质醇相比,RT-PCR显示米非司酮可以部分逆转病理浓度皮质醇对 TGFβRⅡ/Ⅰ、Col2α1、aggrccan的表达抑制作用(P<0.05,P<0.01),CHIP-PCR显示病理浓度皮质醇可以抑制TGFβRⅡ/Ⅰ的组蛋白H3K9乙酰化水平,米非司酮可以部分逆转病理浓度皮质醇对TGFβRⅡ/Ⅰ的H3K9去乙酰化作用。结论:本研究首次发现高浓度的皮质醇可直接诱导人WJ-MSCs软骨定向分化不良及骨关节炎样退变表型易感,并证实其机制为高浓度皮质醇通过激活糖皮质激素受体(GR)诱导TGFβRs组蛋白H3K9去乙酰化,进而抑制TGFβ信号通路及软骨分化标志基因(Col2α1和aggrecan)表达,导致软骨分化不良。TGFβRs去乙酰化可作为IUGR新生儿OA易感的预警分子标志物。