系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种由自身反应性免疫细胞异常活化后产生自身抗体为特征的疾病。病变可累及全身，造成关节、皮肤、肾脏、心脏、肺、血管等各脏器和组织不可逆的慢性破坏和功能丧失。其中狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE最常见也是最严重的并发症，是导致患者死亡的主要原因。该病的病因至今尚无明确定论，可能与遗传及环境等多种因素有关。B7-2分子属于免疫球蛋白超家族成员之一，是抗原递呈细胞(antigen present-ing cell, APC)表面重要的协同刺激分子。其与表达于T细胞表面的CD28结合，介导T细胞活化、增殖、分化及发挥免疫效应。缺乏该信号，T细胞将进入无反应状态（Anergy）或免疫耐受（Tolerance）甚至引起程序性细胞死亡（Apoptosis）。研究发现，B7-CD28协同刺激信号参与了SLE的发生发展，并发挥着重要的作用。B7分子的特异性抗体可阻断或削弱B7-CD28信号，从而抑制免疫应答，因此通过应用B7-2抗体阻断或削弱B7-CD28通路有望为SLE提供新的生物治疗方法。本课题通过建立与人类SLE疾病相似的慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样肾炎小鼠模型。运用自行研制的B7-2单克隆抗体对疾病模型进行干预，从免疫学，血清学，肾脏组织形态学等方面的指标来考察抗体对疾病模型的逆转效应及可能的分子机制。一、B7-2单克隆抗体的制备及鉴定目的：制备B7-2单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定。方法：应用本科室成功建立的稳定分泌B7-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1，采用体内诱生腹水法制备单抗；Protein G免疫亲和层析法纯化抗体；流式细胞术分析单抗对不同细胞膜型B7-2分子的识别。结果：经体内诱生腹水法制备B7-2单抗，小鼠腹水形成阳性率约为80%，腹水收获量平均为3ml/只小鼠；经免疫亲和层析法纯化，腹水中抗体蛋白的得率为3mg/ml；单抗与转人B7-2基因小鼠成纤维细胞株L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.3%、96.7%及61.2%。结论：B7-2单克隆抗体能够特异性识别不同细胞膜型B7-2分子。二、慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型的建立及病理性鉴定目的：对慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型进行免疫学、血清学及肾脏病理损伤鉴定。以考察该模型作为SLE疾病模型的可靠性。方法：将亲代雌性BALB/c小鼠脾脏细胞悬液经尾静脉注射(C57BL/J6×BALB/c) F1代小鼠，每隔3天注射1次，共4次。建模后1周，采用免疫荧光及流式细胞仪分析小鼠脾脏中抗原提呈细胞（APC）及抗体形成细胞的百分率。每隔2周检测血清中anti-dsDNA抗体及ANA；每隔4周检测尿蛋白量的动态变化；建模12周终止实验，取肾脏组织作HE染色观察病理改变，直接免疫荧光法检测免疫复合物（IC）沉积以及透射电镜观察肾小球超微结构变化。结果：流式细胞术的分析结果显示，造模后1周脾脏中膜型CD11b+、CD11c+及GR1+细胞的百分率较对照组明显升高（P<0.05），同时抗体形成细胞B220+表面CD21、CD23、 CD80及CD86分子的表达均上调（P<0.05）；建模2周时，血清anti-dsDNA抗体出现阳性，4周时ANA出现阳性；12周时80%的小鼠存在蛋白尿，蛋白含量++~++++；肾小球体积增大并有大量炎性细胞浸润；肾脏IC沉积；透射电镜下可见肾基底膜节段性增厚，脏层上皮细胞和基底膜之间存在大量的电子致密物。结论：慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型具有人类SLE相似的免疫细胞异常活化及肾脏病理损伤的特征性表现，用于相关研究具有可靠性。三、B7-2单克隆抗体对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及分子机制的研究目的：探讨B7-2单克隆抗体通过阻断或削弱B7/CD28信号通路对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及可能的分子机制。方法：按第二部分的建模方法，取雌性BCF1代小鼠随机分为3组，模型组、抗体干预组及对照组，每组15只。干预组在末次注射淋巴细胞后的第1、3、5、8及15d分别尾静脉注射B7-2单抗(克隆1D1)8mg/kg，然后每月再注射1次，连续注射2次。模型组同一时间给予等剂量的小鼠Ig同型对照。分析脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、中性粒细胞（Gr1+）的百分率及抗体形成细胞B220+细胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子的表达量，anti-dsDNA抗体、ANA含量，尿蛋白含量，免疫复合物，肾小球形态结构和超微结构改变等指标。结果：免疫荧光分析干预组小鼠CD11b+、CD11c+及GR1+细胞的百分率上调程度均低于模型组（p<0.05）；同时干预组B220+细胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子表达上调程度均低于模型组（p<0.05），提示B7-2单抗可以阻断或削弱B7/CD28信号通路，从而抑制机体的免疫应答；模型组90%的小鼠血清能检测到anti-dsDNA抗体和ANA的表达，干预组仅有40%，且干预组的血清抗体滴度明显低于模型组；12周时80%的模型组小鼠存在蛋白尿，蛋白含量++~++++，20%的干预组小鼠存在蛋白尿，蛋白含量为+~++；模型组肾脏组织切片HE染色显示肾脏出现肾小球肿胀，淋巴细胞浸润等典型的炎性改变，干预组肾小球体积轻度增大，少许淋巴细胞浸润，毛细血管腔及球囊腔体积基本正常，两组相比较，干预组肾脏病理学改变轻于模型组；荧光显微镜检查发现模型组肾小球IC沉积，与模型组相比，干预组沉积在肾小球上的IC少于模型组；透射电镜超微结构检查发现模型组基底膜节段性增厚，内皮下大量电子致密物沉积等病理改变，与模型组相比，干预组基底膜厚度均匀，病理改变较轻。结论：B7-2单克隆抗体通过阻断或削弱B7/CD28信号可降低免疫细胞的异常活化，减少自身抗体的产生从而减轻免疫复合物对肾功能的损伤。因此B7-2单克隆抗体的免疫干预可逆转狼疮样肾炎小鼠的病理损伤，提示其对此类疾病具有潜在的治疗效应。