论文部分内容阅读
本文从以下几方面进行论述： 第一部分 Catsper1B细胞表位DNA疫苗的构建及体外表达 目的:构建Catsper1B细胞表位DNA融合疫苗并检测其体外表达,为体内注射避孕疫苗、研究其抗生育效果提供基础. 方法:选用通用辅助T细胞表位PADRE序列插入到真核表达载体pVAX1和pcDNA3.1-EGFP启动子后,同时选择Catsper1基因两个胞外段序列P34和Pp6作为避孕靶点,将其串联重复3次后加入接头序列LINKER(由甘氨酸和丝氨酸构建而成的15个氨基酸分子)以衔接其后的佐剂基因如GMCSF或C3d3,保证融合蛋白的稳定性和生物学活性,表位表达部分委托公司人工合成后,插入真核表达质粒pVAX1中,构建质粒pVAX1-PP.从小鼠肝脏和脾脏中提取组织RNA,经RT-PCR分别扩增出所需佐剂基因补体C3d和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF).通过同尾酶设计的方法实现了3个C3d分子的重复串联,进而构建质粒pVAX1-C3d3;同时构建了pVAX1-GMCSF、pVAX1-PPL-GMCSF、pVAX1-PPL-C3d3和pVAX1-GMCSF-C3d3.同理,构建了表达荧光蛋白的融合表达的质粒pcDNA3.1-EGFP的重组质粒pcDNA3.1-PPL-EGFP、pcDNA3.1-PPL-GMCSF-EGFP、pcDNA3.1-GMCSF-EGFP、pcDNA3.1-PPL-C3d3-EGFP、pcDNA3.1-GMCSF-C3d3-EGFP,经PCR和测序验证正确后,进行相关质粒的少量提取.重组的质粒通过脂质体lipo2000转染HEK293T细胞48小时后,pVAX1的重组质粒转染组提取其细胞总RNA和总蛋白,经RT-PCR和Western Blot检测其体外表达;pcDNA3.1-EGFP的重组质粒通过观察绿色荧光检测插入基因的表达. 结果:RT-PCR扩增的GMCSF基因和C3d基因琼脂糖凝胶电泳后得到了预期大小的条带,经测序验证正确;所构建的重组质粒测序的结果与GenBank中报道的一致;pVAX1的重组质粒转染组经RT-PCR和Western Blot检测到相应大小目的条带;表达荧光蛋白的融合表达的质粒pcDNA3.1-EGFP的重组质粒在荧光显微镜下观察到不同程度的荧光表达情况. 结论:成功构建了Catsper1B细胞表位DNA融合疫苗,并在体外验证了Catsper1B细胞表位重组质粒目的基因的表达. 第二部分 两种物理方式增加小鼠血睾屏障通透性的探索 目的:研究两种物理方式,即阴囊热激和低频低强度超声波对小鼠血睾屏障物质通透性的影响,探索一种可能提高血睾屏障对抗体通透性的方法和实验条件. 方法:动物采用8周雄性SPF级Balb/c小鼠,阴囊热激采用水浴39℃30分钟和43℃30分钟,热激后6小时、18小时、48小时、120小时睾丸注射生物素示踪;低频低强度超声波采用医用全数字超声波治疗仪(威尔德,WED-100;声工作频率1MHz,最大有效声强2.5w/cm2),设置声强1.75w/cm2,超声持续时间为10min,超声后0h、1.5h、3h、6h、12h和24h进行生物素示踪实验.设置声强1.25w/cm2和2.5w/cm2,超声持续时间为2min,5min,10min.在热激和超声处理后不同时间用生物素示踪实验观察血睾屏障的通透性,然后选定通透性增强比较明显的时间点,通过睾丸注射荧光标记的IgG、生物素标记的IgM和SYTO RNASelect Labelled-附睾小体等,冰冻切片后荧光显微镜下观察热激和超声处理后对这些物质的通透性. 结果:我们设置了39℃、41℃和43℃这三个温度进行阴囊热激,热激后6小时、18小时、48小时和120小时生物素示踪实验发现,39℃热激后6小时、18小时、48小时管腔内没有观察到生物素的进入,120小时生物素进入到部分生精小管管腔内;41℃热激血睾屏障开放程度与39℃热激处理后相当;43℃热激后6小时和18小时少许生物素进入到生精小管管腔内,热激后48小时和120小时大部分管腔内均有生物素的分布.39℃阴囊热激后120小时IgG、IgM、附睾小体等生物大分子物质没有进入到生精小管管腔内;43℃热激后48小时IgG和IgM没有进入到生精小管管腔内,但附睾小体进入到管腔中;43℃热激后120小时生精小管管腔内IgG、IgM和附睾小体均进入到生精小管管腔中.我们设置了1.25w/cm2、1.75w/cm2和2.5w/cm2三个声强阴囊超声,超声持续10min,超声后生物素示踪实验发现,在一段时间内生精小管管腔内均能观察到生物素且在超声后1.5小时最明显.1.25w/cm2和2.5w/cm2超声分别持续5min,在超声后1.5h观察到生物素能够进入到部分生精小管管腔内;1.25w/cm2和2.5w/cm2超声分别持续2min,生精小管管腔内没有观察到生物素的分布.2.5w/cm2超声持续5min在超声后12小时仍能观察到生物素进入少许生精小管管腔内;2.5w/cm2超声持续10min在超声后24小时仍能观察到生物素进入部分生精小管管腔内.2.5w/cm2超声持续10min超声后1.5小时IgG、IgM和附睾小体等生物大分子物质没有进入到生精小管管腔内. 结论:39℃阴囊热激和脉冲式非聚焦超声波均可以打开血睾屏障,但是大分子物质如IgG、IgM、附睾小体不能通透.在超声波实验中,随着超声持续时间的增加,血睾屏障的开放程度和开放持续时间也相应增加.43℃阴囊热激是一种较强的打开血睾屏障的物理方式,可以使抗体和外泌体等大分子物质通过血睾屏障.