第一部分RNF6在恶性血液肿瘤中功能的初步分析目的:目前,环指蛋白RNF6在恶性血液肿瘤中的功能及其分子机制尚未报道。本项目首先检测了RNF6在多发性骨髓瘤和白血病病人样本以及细胞株中的表达情况,并利用慢病毒过表达系统和sh RNA干扰技术分析RNF6在多发性骨髓瘤和白血病细胞中的作用,以期阐述RNF6在恶性血液肿瘤中的相关功能。(1)通过q-RT-PCR和RT-PCR方法检测了病人样本以及正常骨髓(NBM)样本中RNF6的m RNA表达水平;(2)利用Immunoblotting技术检测了RNF6在6种多发性骨髓瘤细胞株(H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226)以及7种白血病细胞株(AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697)中的表达丰度;(3)通过生长曲线和集落形成实验检测过表达RNF6对白血病细胞增殖以及集落形成能力的影响;(4)利用sh RNA干扰技术检测沉默RNF6对白血病细胞增殖的影响;(5)通过台盼蓝染色计数法检测白血病细胞中过表达RNF6对硼替佐米敏感性的影响。结果：(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR对病人样本和正常骨髓样本中RNF6的表达进行分析,发现RNF6的m RNA水平在恶性血液病病人样本中存在高表达;(2)与正常骨髓样本相比,RNF6在多发性骨髓瘤和白血病细胞株中蛋白质水平比较高;(3)生长曲线和集落生成实验表明,过表达RNF6能够显著促进白血病细胞生长和集落形成能力;(4)sh RNA沉默RNF6能够明显抑制白血病细胞的生长;(5)利用慢病毒介导RNF6,使之在白血病细胞中高表达,可以显著减弱K562对硼替佐米的药物敏感性。小结：RNF6在多种多发性骨髓瘤和白血病的病人样本和细胞株中均存在异常高表达。同时,过表达或者沉默RNF6以后,都能显著地促进或者抑制癌细胞增殖。以上这些结果表明,RNF6可能与恶性血液肿瘤的发生发展密切相关。另外,过表达RNF6可以减弱K562细胞对硼替佐米的药物敏感性,这提示,RNF6还可能与癌细胞的耐药性相关。第二部分5AHQ对RNF6的转录调控机制分析目的:已有研究发现,喹啉类似物5AHQ具有很强的抗多发性骨髓瘤和抗白血病活性。同时,前期通过DNA Microarray发现,5AHQ可以显著影响RNF6的m RNA水平。本项目将进一步阐述RNF6的转录调控机制,从而进一步揭示5AHQ抗肿瘤的相关分子机制。(1)多发性骨髓瘤和白血病细胞株经5AHQ加药处理24小时后,利用MTT法检测药物的细胞毒活性;(2)5AHQ分别处理多发性骨髓瘤细胞株(OCI-My5和RPMI-8226)和白血病细胞株(AML2和K562)24小时后,提取细胞总蛋白和总RNA,分别经Immunoblotting或者RT-PCR检测RNF6的蛋白或m RNA水平;(3)UCSC网站预测RNF6的启动子序列,并构建RNF6的启动子截断体,然后利用荧光素酶双基因报告系统检测RNF6启动子截断体的荧光素酶活性;(4)利用TFSearch软件预测RNF6核心启动子上可能的转录因子结合位点,并对其进行点突变和缺失突变,检测预测位点对启动子活性的影响;(5)利用CHIP实验检测Pbx1与RNF6启动子区域的结合情况;(6)利用荧光素酶双基因报告系统检测Pbx1/Prep1/MEIS1对RNF6启动子活性的影响;(7)利用Co-IP检测5AHQ对Pbx1/Prep1异源二聚体形成的影响;同时利用荧光素酶双基因报告系统检测5AHQ对RNF6核心启动子活性的影响。结果：(1)MTT结果显示,5AHQ能够显著抑制多发性骨髓瘤和白血病细胞的存活;(2)5AHQ分别处理骨髓瘤和白血病细胞株后,RNF6的m RNA和蛋白水平均显著下调,这说明5AHQ可以下调RNF6的转录并抑制其蛋白的表达;(3)通过缺失突变分析发现,-365/-99是RNF6的核心启动子区域,具有较强的转录活性;(4)利用定点突变和缺失突变技术发现,RNF6核心启动子区域中的Pbx1结合位点能够显著调控RNF6的启动子活性;(5)CHIP实验结果显示,Pbx1可以和RNF6启动子区域结合;(6)当单转染Pbx1时,并不能显著上调RNF6的启动子活性,而当Pbx1与Prep1共转染后发现,可以显著上调RNF6的启动子活性,这说明,Pbx1需要形成异源二聚体后才能调控RNF6的转录;(7)5AHQ可以显著抑制Pbx1/Prep1异源二聚体的形成,以及明显下调RNF6核心启动子的活性。小结：进一步证实了5AHQ可以显著抑制骨髓瘤和白血病细胞存活,并且可以通过抑制Pbx1/Prep1异源二聚体的形成来调控RNF6的转录表达。其中也发现,-365/-99为RNF6的核心启动子,Pbx1转录因子可以介导RNF6的转录。第三部分RNF6泛素化特点的分析目的:RNF6属于环指蛋白家族,环指蛋白家族成员一般都可以发生自身泛素化。本部分将考察RNF6的泛素化情况并寻找其特异性泛素化位点,从而进一步揭示RNF6的泛素化机制。(1)分别加入溶酶体抑制剂(NH4Cl和Chloroquine)以及蛋白酶体抑制剂(MG132和Lactacystin)考察RNF6通过何种方式发生降解;(2)利用免疫共沉淀方法(Co-IP)检测RNF6的泛素化情况;(3)通过定点突变技术(Lysine突变成Arginine)构建RNF6一系列单点突变体、三点突变体和四点突变体,然后通过MG132处理分析这些突变体的泛素化降解情况;(4)通过CHX Chase实验检测WT,K0,K608和K608R蛋白的半衰期;(5)通过转染一系列不同的去泛素化酶,检测RNF6的去泛素化情况。结果：(1)蛋白酶体抑制剂MG132和Lactacystin能够显著聚集RNF6蛋白,而溶酶体抑制剂NH4Cl和Chloroquine并不能影响RNF6蛋白量,这提示RNF6主要通过蛋白酶体途径进行降解;(2)通过Co-IP实验发现,RNF6蛋白能够形成显著的多聚泛素链,同时加入蛋白酶体抑制剂后,RNF6蛋白的多聚泛素链明显增多,这说明RNF6蛋白能够发生多聚泛素化;(3)通过点突变分析发现,RNF6中第608位赖氨酸位点发生突变后,能够明显阻断RNF6的泛素-蛋白酶体降解,表明K608为RNF6的重要泛素化位点。但是K0(Lysine-free)依然能够发生一定程度的泛素化,这说明除了赖氨酸位点外,可能还存在其它的氨基酸位点介导RNF6的泛素化,如半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸等;(4)CHX Chase实验表明,K608R显著延长了RNF6蛋白的半衰期;(5)通过共转染一系列去泛素化酶质粒发现,某些DUBs可以明显上调RNF6的表达水平,其中USP22得到了进一步的论证。小结：环指蛋白RNF6主要通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。同时,RNF6能够发生多聚泛素化,其中K608为RNF6的重要泛素化位点。另外通过去泛素化酶筛选发现,USP22可能为RNF6的去泛素化酶。第四部分RNF6促进GR的泛素化并增强其稳定性目的:近期有研究发现,RNF6作为E3(泛素连接酶)可以介导雄激素受体AR发生非典型泛素化而促进前列腺癌细胞生长。但在血液病细胞中的机制还不清楚。据此,本项目将探索RNF6是否能够影响多发性骨髓瘤细胞中糖皮质激素受体GR的相关功能,从而更进一步阐述RNF6在多发性骨髓瘤发生发展中的作用。方法：(1)通过Immunoblotting检测骨髓瘤和白血病细胞株中GR和RNF6的蛋白表达丰度,并检测骨髓瘤细胞经5AHQ处理后GR和RNF6的蛋白表达趋势;(2)通过质粒共转染方法研究RNF6对GR蛋白表达的影响;(3)CHX chase实验考察RNF6对GR蛋白半衰期的影响;(4)Co-IP分析RNF6与GR是否存在相互作用;(5)利用缺失突变技术构建一系列RNF6与GR的截断体,再通过Co-IP实验分析RNF6与GR在哪一区域发生相互作用;(6)通过Co-IP分析RNF6能否介导GR发生泛素化;(7)使用地塞米松(Dex)或MG132处理分析RNF6对Dex诱导的GR降解的影响。结果：(1)RNF6和GR的蛋白表达丰度基本一致,而且不同骨髓瘤细胞经5AHQ处理后发现,GR和RNF6蛋白表达趋势一致,这暗示RNF6与GR可能存在一定的关联性;(2)RNF6能够上调外源性和内源性GR蛋白水平,而GR的m RNA水平并没有发生变化,这提示RNF6通过影响GR的翻译后修饰上调GR蛋白水平;(3)通过CHX chase实验发现,RNF6能够延长GR蛋白的半衰期;(4)Co-IP实验发现,RNF6与GR存在相互作用关系;(5)缺失突变分析发现,GR蛋白的531-777区域与RNF6发生结合,RNF6蛋白的87-482区域与GR发生结合;(6)通过Co-IP实验发现,RNF6能够促进GR发生非降解型的多聚泛素化,即非典型泛素化;(7)RNF6能够抑制Dex介导的GR蛋白降解。小结：RNF6与GR存在相互作用,并且RNF6结合在GR的LBD结构域区域。另外,RNF6作为E3泛素连接酶,能够促进GR发生非典型泛素化而导致其发生稳定。同时,RNF6能够抑制地塞米松所诱导的GR的降解。结论本研究首先分析了RNF6在多发性骨髓瘤和白血病病人样本和细胞株中的表达情况,发现RNF6存在高表达。另外,通过慢病毒过表达和干扰系统分析发现,RNF6方法:能够影响K562细胞的增殖以及对硼替佐米的敏感性,以上这些结果表明RNF6可能与恶性血液肿瘤的发生发展密切相关。同时发现,抗血液肿瘤化合物5AHQ能够影响RNF6的转录。进一步对RNF6的启动子区域分析发现,-365/-99为RNF6的核心启动子区域,同时转录因子Pbx1与TALE家族蛋白如Prep1等形成异源二聚体后,能够调控RNF6的转录表达。而且,5AHQ可以通过抑制Pbx1与Prep1的异源二聚化,从而抑制RNF6启动子的活化。另外,由于RNF6为环指家族蛋白,能够发生自身泛素化,并主要通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。同时也对RNF6的泛素化位点进行了分析,发现RNF6中的赖氨酸位点K608发生突变后,可以显著抑制RNF6的泛素化降解,这提示K608为RNF6的重要泛素化位点。然而,K0(Lysine-free)仍然能够发生一定程度的泛素化,这表明除了赖氨酸位点外,还存在其它泛素化位点介导RNF6的泛素化,如半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸等。另外,通过探索RNF6与多发性骨髓瘤中GR的关系发现,RNF6与GR能够发生结合,并且RNF6结合在GR的LBD结构域区域。另外,作为E3泛素连接酶的RNF6能够诱导GR发生非典型泛素化而增强其稳定性。同时,RNF6能够阻断地塞米松所诱导的GR的降解。这些结果表明,RNF6可能与GC/GR信号通路相关。总之,本项目首次报道了RNF6在恶性血液肿瘤(尤其是多发性骨髓瘤和白血病)中的相关功能及其分子机制,相信能为以后开发以RNF6为靶点的药物奠定基础。