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克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称红螯虾、淡水小龙虾,在上世纪三十年代传入我国,随后几十年内凭借其较强的适应力、生长力迅速、肉质鲜美和营养价值高等诸多优点占据了我国淡水养殖虾类产业的重要地位,并成为全世界商品价值最高的虾类之一。但近年来,随着克氏原螯虾需求量的不断增加,其养殖规模和养殖密度也不断扩大,诱使各种致病微生物带来的病害频繁发生,严重威胁了克氏原螯虾养殖产业的健康发展,并带来了巨大的经济损失。克氏原螯虾属于无脊椎动物,缺乏适应性免疫系统,仅依靠先天性免疫系统来抵御病原微生物的入侵。因此,对克氏原螯虾先天免疫机制的研究对病害防治尤为重要。本课题对Relish,Toll和Pellino等几种重要的免疫因子在克氏原螯虾先天免疫中的作用进行了研究,并得到以下结果:1、核转录因子NF-κB在无脊椎动物的先天免疫中起着关键作用,Relish即是NF-κB家族中的一员。从克氏原螯虾(P.clarkii)中鉴定出两种Relish亚型(SPc Relish和LPc Relish)并对它们进行了功能分析。长亚型LPc Relish由完全剪接产生,包含25个外显子和24个内含子,c DNA全长4961bp,编码包含1187个氨基酸的蛋白质;而短亚型SPc Relish由内含子保留的可变剪接产生,包含外显子1-9以及保留了内含子9,c DNA全长2696bp,编码由418个氨基酸组成的多肽。LPc Relish蛋白包含Rel同源结构域(RHD)、ig样结构域、丛蛋白、IPT结构域和锚蛋白(ankyrin,ANK)重复序列抑制结构域。然而,SPc Relish只包含RHD和IPT结构域,没有ANK结构域。副溶血性弧菌感染克氏原螯虾可以调控其体内SPc Relish和LPc Relish的转录。另外,将SPc Relish基因干扰后,再用副溶血弧菌感染虾体,发现有一些抗菌肽(ALF-7032、ALF-13162和Crustin-42012)的表达明显减少抑制,而另一些抗菌肽(ALF-41125、ALF-42430、Crustin-41354和Crustin-42993)的表达明显增加。与SPc Relish有所不同,将LPc Relish基因沉默后,再用副溶血弧菌感染虾体,发现除ALF-41125基因外,以上所有受试抗菌肽的表达均被抑制。这些结果表明由可变剪接产生的两种Relish亚型可能作为机体免疫系统的重要机制来促进免疫因子的多样性,进而导致Relish转录因子免疫功能的多样性。2、Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是参与先天免疫的一类重要分子。在克氏原螯虾中克隆得到三种新的Toll基因(Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc)。q RT-PCR分析表明这三个Toll基因均广泛分布于雌性和雄性克氏原螯虾的多种免疫组织,并在雌雄克氏原螯虾的肠道中表达量最高。在白斑综合症病毒(WSSV)刺激后,肠道中Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc三种Toll基因的表达均显著上调。将Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc基因敲低后,再用WSSV刺激虾体,结果显示这三个Toll基因可以调控多种抗菌肽基因的表达。其中,Pc Tolla能够调控克氏原螯虾肠道中ALF-7032、ALF-9228、ALF-42430、Crustin-42012和Crustin-42993的表达;Pc Tollb能够调控ALF-13162、ALF-9228、ALF-42430、Crustin-41354和Crustin-42993的表达;Pc Tollc能够调控ALF-13162、ALF-9228、ALF-41125、Crustin-42012、Crustin-41354和Crustin-42993的表达。以上研究表明克氏原螯虾的Pc Tolla、Pc Tollb和Pc Tollc基因在克氏原螯虾对抗WSSV侵染的过程中作为模式识别受体参与调控抗菌肽的表达,并发挥重要作用。3、Pellino作为E3泛素连接酶,在先天性免疫反应中同样发挥着不可或缺的作用。在克氏原螯虾中鉴定到一个新的Pellino基因(命名为Pc Pellino)。该基因的c DNA序列全长为1872 bp,包括1305 bp的开放阅读框(ORF),编码由434个氨基酸组成的蛋白质,且该蛋白质包含低复杂度区域和Pfam:Pellino结构域。组织分布分析表明,Pc Pellino广泛分布于克氏原螯虾的所有受试组织,并在鳃和肠道中表达量相对较高。在细菌(副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌)和白斑病毒(WSSV)感染后,Pc Pellino在鳃和肠道中的表达量均显著上调。将Pc Pellino基因干扰后,再分别用副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和WSSV感染虾体,随后检测多种抗菌肽基因的转录水平。结果显示,在克氏原螯虾鳃组织中,副溶血弧菌刺激组Pc Pellino基因的敲除可显著降低ALF-9228、ALF-41125、Crustin-41354和Crustin-42993的表达水平,而增加ALF-13162的表达水平;在金黄色葡萄球菌刺激组,Pc Pellino基因的敲除可显著降低ALF-13162、ALF-9228、ALF-42430和Crustin-41354的表达水平;在WSSV刺激组,Pc Pellino基因的敲除可显著降低ALF-7032、ALF-42430、ALF-41125、Crustin-41354和Crustin-42993的表达水平。另一方面,在克氏原螯虾肠道组织中,副溶血弧菌刺激组Pc Pellino基因的沉默可显著减少ALF-7032、ALF-13162、ALF-42430和ALF-41125的转录;在金黄色葡萄球菌刺激组,Pc Pellino基因的沉默可显著减少ALF-7032、ALF-42430、ALF-41125、Crustin-42012和Crustin-41354的表达水平;在WSSV刺激组,Pc Pellino基因的敲除可显著降低ALF-7032、ALF-9228、ALF-42430、ALF-41125和Crustin-41354的表达水平。以上结果表明Pc Pellino基因参与调控克氏原螯虾先天免疫应答中的抗菌肽基合成过程,并且在泛素化过程中发挥着重要的作用。