论文部分内容阅读
目的:1.探讨三七总皂苷对局灶性脑缺血MCAO大鼠模型皮质及海马可塑性的影响及对Nogo-A受体NgR及其下游RhoA信号调控通路的调节作用2.探讨三七总皂苷对局灶性脑缺血后大鼠血清IL-1p及TNF-α的含量的影响以及炎症因子与神经再生抑制的相关性3.探讨三七总皂苷对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及对NGF、p75和TrkA的调节作用(公派留学实验部分)方法:1.取SPF级Sprague-Dawley大鼠112只,随机抽取假手术组8只大鼠,其余大鼠采用改良Longa方法制备局灶性脑缺血(MCAO)模型,随机将造模成功的大鼠分为模型组、三七总皂苷(PNS)组、Y27632组、PNS+Y27632组以及尼莫地平组。所有动物在术后每天观察记录各组大鼠一般状态、体重和神经功能学评分;于7d时取脑组织观察HE染色后病理形态学变化,免疫组织化学染色后PSD-95蛋白、Syp蛋白、Nogo-A蛋白、NgR蛋白以及RhoA蛋白阳性表达情况;Western Blot方法及RT-PCR方法检测Nogo-A、NgR1NgR2及其下游通路RhoA的表达;ELISA方法检测大鼠血清IL-1p及TNF-α的表达。2.培养SH-SY5Y细胞分为六组,分别为正常组,Aβ模型组,三七总皂苷组300mg/L组,三七总皂苷组600mg/L组,以及PNS300mg/L+Aβ组,PNS600mg/L+Aβ组。采用15μM Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤,采用MTT法观察三七总皂苷对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用;采用免疫荧光染色、Western Blot方法观察三七总皂苷对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤后NGF、p75和TrkA的调节作用。结果:1.本实验中假手术组,进食进水正常,体重呈稳定上升趋势。第2天,由于手术应激各手术组体重与假手术组相比明显下降(P<0.01)。第3到5天,手术各组体重继续下降,其中模型组下降明显,但与各治疗组的差异无统计学意义(P>0.05)。第6到7天,各组动物主动饮水进食行为也逐渐增多,治疗组明显,PNS+Y27632组体重出现增加趋势,与模型组相比增加具有统计学意义(P<0.05); PNS组与尼莫地平组也呈现平稳趋势,但与模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。2.本实验在各时间点假手术组大鼠活动正常,无神经功能缺损症状,评分均为0分。手术各组在手术当天评分较高,神经功能缺损严重,与假手术组相比评分差异具有统计学意义(P<0.01)。第2天,缺损的神经功能有所恢复,评分开始下降,其中Y27632组与模型组相比,神经功能评分下降明显,差异具有统计学意义(P<0.05),其余各组均有下降,但无统计学意义(P>0.05)。第3到4天,模型组神经功能缺损状态基本稳定,PNS组、PNS+Y27632组以及尼莫地平组均出现较为明显的下降,差异与模型组相比具有统计学意义(P<0.05)。第5到6天,模型组大鼠的神经功能略有恢复,其他各给药组与模型组相比无明显差异。第7天,各给药组神经功能评分均低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.第7天,模型组大鼠在脑部梗死中心区、梗死周围皮层区及海马区的Syp和PSD-95免疫阳性产物较假手术组大鼠稀而少而且染色较浅,表达量低于假手术组。各治疗组在大鼠脑部梗死中心区、梗死周围皮层区及海马区的Syp和PSD-95的表达量均多于模型组;假手术组大鼠脑切片可见Nogo-A、NgR1及RhoA免疫阳性物散在分布,颜色较浅。与假手术组大鼠相比,模型组大鼠在梗死中心区、梗死周围皮层区及海马区的Nogo-A、NgR1及RhoA的表达增多;各治疗组在大鼠脑部梗死中心区、梗死周围皮层区及海马区的Nogo-A、NgR1及RhoA的表达量均少于模型组。4.第7天,模型组大鼠皮层Nogo-A、NgR1、NgR2、RhoA的蛋白表达水平较假手术组大鼠显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。PNS组对大鼠皮层区Nogo-A、 NgR1和RhoA的表达与模型组相比降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),但PNS对于NgR2的作用不明显。Y27632组在皮层NgR1、NgR2、RhoA的表达与模型组相比均下降,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),但对于Nogo-A的调节作用不明显,虽然与模型组相比有降低作用,但差异没有统计学意义。PNS+Y27632组的Nogo-A、NgR1和RhoA的表达量较模型组的表达低,且差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),尼莫地平组的梗死区Nogo-A、NgR1、RhoA的表达明显低于模型组的表达,差异具有统计学意义(P<0.01)。但对于NgR2的调节作用不明显。神经功能评分与RhoA的蛋白表达具有相关性。5.假手术组大鼠皮层Nogo-A、NgR1、NgR2、RhoA的mRNA有正常的基础表达。第7天时,模型组大鼠皮层Nogo-A、 NgR1及RhoA的rnRNA的表达水平较假手术组大鼠显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),但其中NgR2在模型组的表达尽管较假手术组上升,但差异没有统计学意义。PNS组在皮层区的Nogo-AmRNA的表达较模型组相比降低明显(P<0.01),但对于NgR1、NgR2以及下游信号RhoA的mRNA的表达虽有减低表达的作用,但是差异并没有统计学意义,Y27632组对NgR1的mRNA调节作用明显,与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),PNS+Y27632组的NgR1和RhoA的mRNA的表达量较模型组的表达低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),尼莫地平组的Nogo-A及受体NgR1、NgR2和下游信号RhoA的mRNA表达与模型组的表达相比较,均有下降,对NgR1和RhoA的调节作用明显,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),其余无统计学意义。神经功能评分与Nogo-A的mRNA表达具有相关性。6.在MCAO手术第7天,模型组大鼠血清IL-1β和TNF-α的表达水平较假手术组大鼠明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。各治疗组IL-1β和TNF-α的表达量较模型组的表达低,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。大鼠血清IL-1β和TNF-α与Nogo-A、 NgR1、NgR2和RhoA的相关性研究结果发现,各组大鼠血清炎症因子IL-1β和TNF-α的含量变化与各组的神经抑制因子具有某些相关性。其中用Western Blot方法检测神经抑制因子表达的结果中,IL-1β和TNF-α与NgR1和RhoA的蛋白表达相关性较强,具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而与Nogo-A和NgR2的蛋白表达相关性差。而与采用RT-PCR检测的结果来看,IL-1p与NgR1的mRNA的表达相关性较强,具有统计学意义(P<0.01),而与Nogo-A、NgR2和RhoA的mRNA表达相关性较差。而TNF-α与Nogo-A、 NgR1、NgR2和RhoA的mRNA的表达Pearson检验无相关性(P>0.05)。7.Aβ模型组显示神经元突起明显缩短,或者折断,细胞体积增大,细胞数量减少,细胞活性明显下降,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。各给药组与正常组比较显示三七总皂苷具有明显的促进增值作用,在加入15μM的Aβ后,与模型组相比较三七总皂苷有明显的保护作用,尤其是三七总皂苷高剂量组,细胞活性较模型组明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。三七总皂苷高剂量组与低剂量组相比,增强细胞活性的作用具有剂量依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。8.正常组NGF、p75和TrkA有基础表达,Aβ模型组NGF和TrkA的表达水平较正常组降低,而p75在模型组的表达增高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。PNS低剂量+Aβ组的NGF和TrkA表达较模型组升高,但差异无统计学意义(P>0.05),p75的表达较模型组稍降低,差异有统计学意义(P<0.05) PNS高剂量+Aβ组的NGF和TrkA表达较模型组升高,p75的表达较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论:1.三七总皂苷可以改善大鼠局灶性脑缺血后的神经症状,对神经功能重塑有积极作用。2.三七总皂苷可以提高大鼠局灶性脑缺血后的PSD-95、Syp的表达,促进轴突的再生重塑。3.三七总皂苷具有降低大鼠局灶性脑缺血后Nogo-A、NgR及RhoA的蛋白及mRNA表达,神经功能恢复与Nogo-A、RhoA的表达具有相关性。4.三七总皂苷能降低大鼠局灶性脑缺血MCAO术后大鼠血清炎症因子IL-1β和TNF-α的含量;IL-1β和TNF-α的表达与神经抑制因子Nogo-A的受体NgR1和下游通路RhoA的表达具有相关性。5.三七总皂苷对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用且可能与增加了NGF、TrkA和降低了p75的蛋白的表达有关。