家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nnucleopolyhedrovirus,BmNPV)引发的家蚕脓病是蚕业生产中最严重的的病害。BmNPV属于Group I杆状病毒,已有研究表明BmNPV的出芽型病毒粒子以巨胞饮内吞方式入侵宿主细胞。Ac MNPV(Autographa californica nucleopolyhedrovirus)和BmNPV同为Group I杆状病毒代表性病毒,也是研究比较清楚的两种病毒,Ac MNPV以Clathrin介导的内吞方式入侵宿主细胞,低pH值诱导的直接膜融合方式也能促使Ac MNPV有效感染宿主细胞,而直接膜融合方式能否BmNPV入侵宿主细胞尚不清楚。第一章:文献综述。首先介绍了杆状病毒的分类、病毒感染循环过程及病毒入侵方式;其次,综述了包膜病毒入侵过程,膜融合发生过程的分子机制;最后,比较分析了国内外在Ac MNPV以及BmNPV的一些研究进展及入侵机制方面的研究成果。第二章:低pH值诱导的直接膜融合方式介导BmNPV入侵宿主细胞研究。首先确定BmNPV GP64适合的pH。在Bm N细胞中瞬时表达BmNPV膜融合蛋白GP64,而后利用不同pH的条件诱导其发生膜融合,通过统计膜融合指数确定GP64的最佳融合pH。结果表明,在pH值5.0时细胞膜相互融合,形成较大合胞体,pH值为4.5时合胞体数量最多;统计结果显示,融合率随pH值降低而上升。推到得知BmNPV GP64介导发生膜融合条件为pH值小于5.0。接下来,利用氯化铵处理Bm N细胞,再用BmNPV进行感染,使用pH 4.5条件诱导其发生膜融合后正常培养,细胞流式结果分析低pH条件下病毒感染性变化;结果显示低pH值诱导会导致病毒感染率降低;最后,利用e GFP融合VP39的标记病毒,示踪了病毒以直接膜融合方式入侵后核衣壳的转运,结果表明病毒粒子虽然进入细胞质内,但没有被运送到细胞核内,导致了病毒的感染失败。第三章:直接膜融合介导BmNPV感染细胞的转录组分析。为了探索病毒核衣壳转运失败的原因,研究以BmNPV正常感染细胞样品为对照,对低pH诱导BmNPV直接膜融合的方式入侵后0/15/60分钟的样品进行高通量测序,以寻找参与该过程的宿主因子。通过对差异表达基因的GO、KEGG分析,共获得了95个差异基因,其中参与核糖体通路中有22个差异基因,内质网蛋白加工途径中有6个差异基因,剪切体通路中4个,吞噬体通路中有3个。其中热激蛋白Hsp90、钙网蛋白CRT、重链结合蛋白Bi P是差异表达的热点蛋白。第四章:差异蛋白的分析与验证。为了确定差异表达蛋白在BmNPV入侵过程中的作用,利用荧光定量PCR验证了Hsp90、CRT、Bi P的表达,并利用RNAi技术敲低Hsp90、CRT及Bi P的表达,测定病毒的感染效率。q PCR结果验证了细胞免疫相关基因Hsp90、蛋白分泌折叠相关基因CRT、Bi P的表达,所得结果与转录组测序结果相吻合;RNAi有效降低细胞内CRT、Bi P及Hsp90的表达,进而导致BmNPV感染效率降低。本研究表明低pH诱导的直接膜融合会导致BmNPV感染失败,而这是由于核衣壳不能被转运到细胞核内引起的,高通量测序分析确定的差异表达的宿主细胞因子参与BmNPV入侵,为深入了解BmNPV入侵机制奠定基础。