臭氧是由太阳辐射使氧分子分解后,一个氧原子和另一个氧分子结合而成,是地球大气层中的一种蓝色、有刺激性的微量气体,也是平流层大气的最关键组成组分。尽管臭氧层在地球表面只占大气层的百万分之几,却吸收了来自太阳99%的高强度紫外线(ultraviolet, UV),保护了人类和生物免遭紫外线的伤害。但是由于一些自然因素,以及一些人类活动对环境的影响,使地球上方的臭氧层遭到破坏继而出现大面积的臭氧空洞,臭氧空洞形成无疑会导致大气层对来自太阳的紫外线的阻挡作用大大减弱,使辐射到地球上的紫外线增强,从而对生物产生一些危害效应。2006年9月,南极臭氧空洞的面积达到2950万平方公里,总面积超过了3个中国,而且,据科学家们预计,在今后的10-20年中的时间内,臭氧空洞仍有可能恶化。虽然现在全球都在采取一些必要的措施如在制冷剂中使用氟利昂的替代品等的来努力减少对臭氧层的继续破坏,甚至在将来有可能使地球上方的臭氧层空洞得以修复,但是据世界卫生组织估计,地球上的动物、植物以及浮游生物等在未来的40-100年里还将会受到越来越多的紫外线特别是紫外线B的辐射作用,这不仅对人类的健康本身造成危害,如皮肤癌症、机体免疫的损害、晶体甚至视网膜的损伤等,而且会对人类的生存环境也能造成不可估量的影响。来自太阳的紫外线按其波长的不同可分为UVA(波长：315-400nm)、UVB(波长：280-315nm)、UVC(波长：100-280nm)三种紫外辐射。由于大气层的阻挡作用,所有的UVC和大约90%的UVB能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收,UVA则较少受到大气的影响,因此,到达地面的紫外线主要是UVA和少量UVB。同时,地球上方的臭氧层对紫外线的吸收作用急剧下降的区域,为310nm-315nm的范围内,此即UVB的波长范围,也就是说,地球臭氧层的破坏,会导致到达地球表面的UVB的量迅速增加,因此UVB对生物体的损伤作用,越来越得到世界各国的关注。人类的皮肤覆盖于机体表面,是抵抗外界损伤的第一道防线,会比其他器官接受更多来自外界环境的辐射例如紫外线及可见光的辐射。照射到皮肤的紫外线95%的被角质细胞所吸收。环境中UVB的增加,无疑会加重对皮肤角质细胞的损伤,例如引起皮肤红斑和炎症反应。因此,本实验中选用了人永生化上皮细胞(HaCat细胞)作为研究对象,以波长为310nm的UVB作为干预因子,深入研究UVB作用于细胞后经由多种信号转导通路而调节细胞周期的机制。以往的研究表明,UVB至少可以通过下述四种途径破坏细胞的正常功能、影响细胞的生存状况如导致细胞的坏死或凋亡等：1：对细胞DNA的直接损伤；2：激活神经鞘磷脂酶使之降解神经鞘磷脂,从而导致“第二信使”神经酰胺及其衍生物水平增加：3：活化细胞膜表面的死亡受体如CD95等；4：经由对细胞膜和线粒体膜的作用而产生自由基和脂质过氧化产物。那么,UVB作用于HaCat细胞,终究是通过哪些机制引起HaCat细胞产生损伤效应,涉及到MAPK信号途径的哪些通路呢,又有哪些信号分子涉及到其作用机制中呢?这成了我们的实验关注的一个重点。本研究分三个阶段,首先在实验一中用不同剂量的UVB照射HaCat细胞,并在UVB照射后在不同的时间点,观察了细胞的活性、细胞凋亡的变化情况,并观察了p38、p42/p44、p53、PARP、14-3-3σ等分子的变化情况,然后根据实验一发现的14-3-3σ表达在UVB照后出现改变的现象,以及文献调研总结出的14-3-3σ在细胞凋亡／周期阻滞中的作用,认为为了今后进一步深入研究14-3-3σ在UVB导致的细胞信号通路中的作用,建立14-3-3σ蛋白干扰和高表达的HaCat细胞株是非常有必要的,因此进行了实验二和实验三的研究,即分别构建了14-3-3σ稳定干扰和稳定高表达的HaCat细胞株。目的：1、探讨p38信号途径是否参与了UVB导致的细胞凋亡及其作用机制；2、探讨ERK信号途径是否参与了UVB导致的细胞凋亡；3、探讨UVB照射后,14-3-3σmRNA表达情况；4、构建14-3-3σ干扰逆转录病毒载体,建立其稳定转染的HaCat细胞系；5、构建14-3-3σ逆转录病毒载体,并建立高表达14-3-3σ的HaCat细胞系。方法：本研究方法主要包括三部分。第一部分1、以HaCat细胞为实验材料,“MTT”法观察HaCat细胞受到lmin、3min、5min、10min、15min的UVB照射后,分别在照后Oh、3h、6h、9h、12h、18h、24h和30h的细胞存活率；2、HaCat细胞接受假照、以及UVB分别照射HaCat细胞lmin、3min、5min、8min、10min,在照后4h、8h、12h、24h,用Hoechst33258染料对HaCat细胞进行染色,并用荧光显微镜观察HaCat细胞凋亡的情况；3、5min的UVB射线照射HaCat细胞,在照后12h收集细胞,并用weatern blotting免疫印迹法观察p38、p44/p42、p53、PARP等蛋白的表达改变情况；4、分别用不同剂量(假照、UVB照射lmin、3min、5min、8min、10min)的UVB照射HaCat细胞,在照后1h收集细胞和用5min的UVB照射HaCat细胞,在照后Oh、1h、2h、4h、6h、12h收集细胞,提取细胞的总RNA,并通过反转录PCR反转录成cDNA,用1%的琼脂糖凝胶电泳,观测14-3-3σmRNA表达情况的改变。第二部分5、通过GeneBank检索14-3-3σ的全长序列,遵循siRNA设计的原则,在线寻找了三个合适的干扰靶位点,分别针对这三个靶位点设计并合成三对ShRNA的干扰片段,并定向插入到pSuper-retro-EGFP/neo质粒中。6、pSuper-retro-EGFP/neo质粒转化到大肠杆菌DH5α细菌体内进行质粒扩增,菌落PCR鉴定,筛选出的阳性克隆进行测序鉴定。7、分别将测序结果显示正确的质粒通过LipofectamineTM2000瞬转HaCat细胞48h,通过western blotting免疫印迹法筛选出干扰效果最好的质粒,用该质粒转化STBL3菌株进一步进行质粒扩增。将获得的pSUPER-retro-EGFP/neo-si-14-3-3o质粒和PIK包装质粒、293FT细胞共培养进行病毒包装和扩增,获取逆转录病毒载体。8、将获得的逆转录病毒载体感染HaCat细胞,共感染三次,经6418持续压力筛选后,获得14-3-3σ稳定干扰的HaCat细胞株。9、为验证干扰效果,通过western blotting免疫印迹和实时荧光定量PCR的鉴定14-3-3σ的mRNA和蛋白的表达情况。第三部分10、首先通过对GeneBank提供的14-3-3σ基因全长序列进行的分析,发现14-3-3σ基因可用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切,并置于CMV IE启动子之后。因此选用pLEGFP-N1质粒作为空载质粒,并设计扩增14-3-3σ的上游引物和下游引物,该引物中同时包含BglⅡ和BamHⅠ酶切位点以及它们的保护碱基。11、以人的基因组作为模版,选用高保真的DNA连接酶,通过普通PCR扩增出14-3-3σ基因的全长序列,将扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的目的DNA片段。12、把14-3-3σ基因的胶回收产物和pLEGFP-N1载体分别用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切后,用TaKaRa的T4 DNA连接酶进行连接,转化感受态的大肠杆菌DH5α,并进行菌落PCR酶切鉴定,阳性克隆测序。13、将测序结果显示正确的pLEGFP-Nl-14-3-3σ质粒在STBL3菌株中进一步扩增。14、pLEGFP-N1-14-3-3σ质粒和PIK包装质粒、293FT细胞共培养进行病毒包装、扩增和纯化,获取逆转录病毒载体。15、将获得的逆转录病毒载体感染HaCat细胞,共感染三次,经G418持续压力筛选后,获得14-3-3σ高表达稳定细胞株。16、为验证表达效果,通过western blotting免疫印迹和实时荧光定量PCR的鉴定14-3-3σ的mRNA和蛋白表达情况。结果：实验一部分：1、UVB照射HaCat细胞,在剂量相同情况下,随着照射后培养细胞的时间延长,HaCat细胞存活率呈现先下降后上升的趋势,即下降到最低值后恢复。UVB照射haCat细胞剂量不同,但照后相同的培养时间的情况下,随着照射剂量的增加,HaCat细胞存活率逐渐减少,而且15min的UVB照射组,在照后30h仍未出现恢复。2、不同的UVB照射剂量和UVB照射后不同时间之间,HaCat细胞的凋亡率均有显著差异(P<0.05)。UVB照射5min组的凋亡率在照后各个时间点均比UVB照射HaCat细胞0min、1min、3min组凋亡率高(P<0.05),和UVB照射8mmin、10min比,在UVB照后12h,UVB照射5min组的凋亡率比8min、10min组高,差异显著(P<0.05)。UVB照射5min组,在照后培养12h时,凋亡率最高。3、p44/42的含量在UVB照后不同时间点没有明显变化；而p38含量在UVB照后4h呈现递增性增加,至24h仍然高表达；p53在UVB照射后呈递增性增加,至24h仍高表达；PARP在UVB照后呈递增性增加,在UVB照后12h含量下降,而其降解产物在照后同样呈递增性增加,至12h达高峰,24h时含量下降。4、不同剂量,即假照组、UVB照射Hacat细胞1min、3min、5min、8min、10minUVB组,14-3-3σmRNA的表达在3min、5min、8min、10min照射组均见到表达量的明显增加;5minUVB照射,假照组和照后1h、2h、4h、6h、12h组相比,照后1h即有mRNA的表达增加。实验二部分：5、分别针对14-3-3σ基因的不同的靶位点,设计并合成了三条14-3-3σ的干扰序列,并筛选出干扰效果最好的一条序列。即针对14-3-3σ基因第195至第214位点设计的干扰序列RNAi-5’-ACCTGCTCTCAGTAGCCTA-3’,干扰效果最好,其正义链为5’GATCCCC ACCTGCTCTCAGTAGCCTA TTCAAGAGA TAGGCTACTGAGAGCAGGT TTTTT A3’,反义链为Sh-14-3-3σ-R3 5’AGCTT AAAAA ACCTGCTCTCAGTAGCCTA TCTCTTGAA TAGGCTACTGAGAGCAGGT GGG 3’。6、干扰序列和pSUPER-retro-EGFP/neo质粒连接重组后,经过菌落PCR鉴定,筛选出阳性克隆,进一步的测序结果表明,成功合成了pSUPER-retro-EGFP/ neo-si14-3-3σ质粒。并和包装质粒PIK、293FT细胞共培养产生pSUPER-retroEGFP/neo-si14-3-3σ逆转录病毒载体。7、pSUPER-retro-EGFP/neo-si14-3-3σ逆转录病毒载体稳定转染的HaCat细胞在倒置显微镜下呈绿色荧光,表明细胞中有外源性基因的表达。8、通过实时荧光定量PCR检测,发现14-3-3σ稳定干扰HaCat细胞株和HaCat细胞株相比,其14-3-3σmRNA表达明显下降,平均抑制率达到70%以上。9、通过weatern blotting免疫印迹检测稳定转染的HaCat细胞14-3-3σ蛋白的表达结果显示,稳定转染株和HaCat细胞株相比,14-3-3σ的表达明显降低。实验三部分：10、以人的基因组为模板,成功扩增出14-3-3σ的全长序列,并进行酶切鉴定,大小和目的基因相符。11、将14-3-3σ基因和pLEGFP-N1质粒连接重组后,经菌落PCR鉴定筛选出阳性克隆,再进行酶切鉴定和测序鉴定,其结果都表明成功合成了pLEGFP-N1-14-3-3σ质粒。12、pLEGFP-N1-14-3-3σ质粒,PIK包装质粒、293FT细胞共培养产生pLEGFP-N1-14-3-3σ逆转录病毒载体。13、pLEGFP-N1-14-3-3σ逆转录病毒载体稳定转染的HaCat细胞在倒置显微镜下呈绿色荧光,表明细胞中有外源性基因的表达。14、通过实时荧光定量PCR检测,发现14-3-3σ高表达HaCat细胞株和HaCat细胞株相比,其14-3-3σmRNA表达明显上调,平均增强效率达2.71倍。15、通过weatern blotting免疫印迹检测稳定转染的HaCat细胞14-3-3σ蛋白的表达结果显示,14-3-3σ稳定转染的HaCat细胞株和HaCat细胞株相比,14-3-3σ的表达明显增强。结论：1、UVB照射,能引起HaCat细胞的生长抑制和细胞凋亡,且呈剂量依赖性和时间依赖性；2、UVB诱导细胞凋亡的可能途径之一是通过p38信号途径,而不是ERK信号途径；3、UVB照射HaCat细胞,能引起14-3-3σmRNA表达的增加；4、成功构建了pSUPER-retro-EGFP/neo-si14-3-3σ逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系；5、成功构建了pLEGFP-N1-14-3-3σ逆转录病毒载体,并构建了其稳定转染的HaCat细胞系。