目的:　　 创伤后应激障碍(PTSD)是指由异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。其特征性的症状为病理性重现创伤体验、持续性警觉增高、持续性回避、对创伤性经历的选择性遗忘以及对未来失去信心等。随着现代社会交通伤亡、暴力事件等社会应激事件的增多和自然灾害(如地震、火山、洪水等)的发生,PTSD已经成为影响创伤救治整体水平的重要因素之一,严重干扰了人民生活和社会秩序而备受关注。　　 应激反应主要由交感肾上腺髓质系统(SAS)的快速激活和下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAaxis)的兴奋激活来激发,且二者之间存在着协同性。许多研究显示,PTSD患者其血、尿中的最终靶激素-糖皮质激素(glicocorticoid,GC)水平却低于正常;与此同时,SAS则表现出高活动性。因此,PTSD患者中可能存在着HPA与SAS的“分离”现象,即GC不能限制、调节SAS反应,导致儿茶酚胺(由SAS释放)所致的记忆加强。蓝斑(locuscoeruleus,LC)主要由去甲肾上腺素能细胞构成,是脑内去甲肾上腺素能细胞的主要集中地,参与调节植物性神经活动。蓝斑能纤维影响中枢所有区域的神经活动,与排尿、学习记忆、嗅行为、呼吸、循环、泌尿、针刺镇痛和睡眠(调节异相睡眠)等机能有关。此外,蓝斑可通过其广泛传出联系维持中枢神经系统的觉醒状态。　　 蓝斑对应激的反应是经蓝斑到杏仁核、海马的通路,通过激活边缘系统来完成。目前基于动物实验的数据表明:在一个创伤后蓝斑通路经过长期的强化,特别在应激的状态下,成为重复闯入性再体验的基础,这一现象是研究PTSD疾病的一个突破口。细胞骨架蛋白的变化势必会影响细胞的功能,并有可能启动神经元的自杀程序,引起凋亡。生长锥蛋白是凋亡相关蛋白,生长锥蛋白-纽蛋白(vinculin)是重要的凋亡蛋白。缝隙连接蛋白(Connexin43,Cx43)和整合素(Lntegrin)是细胞间连接蛋白,在细胞凋亡中也出现相应的改变。Caspase-12(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12)是内质网应激介导凋亡途径的关键凋亡因子。Nakagawa等证实caspase-12)存于内质网上,他在诱导细胞ERS(内质网应激)实验中,发现细胞出现凋亡,而caspase-12基因缺乏细胞经ERS反应时,细胞凋亡受抑制,说明caspase-12是ERS反应诱导凋亡的关键分子。PTSD是引起细胞应激性反应,故检测caspase-12表达变化是否引起细胞凋亡。　　 β-catenin(β-连环蛋白)是wnt通路中的关键因子,Wnt通路与多条信号转导通路存在“对话”,参与多种细胞发育和细胞死亡的调节。它可以通过多种机制来控制细胞的凋亡,Rhee等研究发现,在一些细胞受损发生凋亡时,Wnt通路通过β-catenin/Tcf的转录调节途径来调节细胞凋亡。Wnt通路也可以抑制线粒体释放细胞色素C从而抑制细胞凋亡。　　 “单一连续刺激(singleprolongedstress,SPS)”SPS动物模型是目前探讨PTSD发病机制的较理想的实验模型,该方法已经被国际所认同。因此本研究采用PTSDSPS模型,采用免疫组织化学、Western及RT-PCR方法,从蛋白和分子水平检测整合素、缝隙连接蛋白、纽蛋白及β-catenin,并用RT-PCR方法检测caspase-12mRNA的改变,旨在探讨PTSD蓝斑神经元凋亡导致功能紊乱的发生机制,为揭示PTSD的发病机制提供实验依据。　　 实验方法:　　 1、模型制作及分组　　 采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS模型。其具体方法是将大鼠按下述步骤连续进行处理:固定刺激2h;强迫性游水20min,水深40cm,水温25℃;休息15min;乙谜麻醉至意识丧失;无干扰空间常规喂养。随机分为5组,即正常对照组及SPS1d、4d、7d、和14d组。　　 2、免疫组织化学方法检测整合素、缝隙连接蛋白、纽蛋白及β-catenin的表达　　 免疫组化:分别选取各组大鼠灌流固定、沉糖的大脑,制作石蜡切片,分别用SABC法进行蓝斑的骨架蛋白、β-catenin免疫组织化学染色,DAB显色,中性树胶封片,光学显微镜观察,摄片。　　 3、WesternBlotting方法检测整合素、缝隙连接蛋白、纽蛋白及β-catenin的表达　　 WesternBlotting:分别取新鲜蓝斑经匀浆、超声粉碎后高速低温离心,提取上清蛋白,电泳,转膜,经封闭后分别加一抗4℃过夜;HRP标记IgG孵育2h,ECL发光,检测条带各光密度值。　　 4、RT-PCR法检测整合素、缝隙连接蛋白、β-catenin及Caspase-12的mRNA表达　　 RT-PCR:断头取脑分离蓝斑,提取总RNA,进行逆转录和PCR扩增。扩增结束后进行凝胶电泳,成像并进行积分光密度分析。　　 5、透射电镜技术观察蓝斑神经元超微结构改变　　 常规电镜制样,倒扣包埋、聚合、半薄切片定位,AO超薄切片机进行超薄切片,透射电镜下观察。　　 结果:　　 1、整合素、缝隙连接蛋白的免疫组化、WesternBlotting及RT-PCR的检测结果　　 阳性细胞均在细胞胞质中表达,各项表达均于SPS4d达高峰,SPS7d和SPS14d逐渐下降。　　 2、β-catenin免疫组化、WesternBlotting的检测结果　　 β-catenin阳性细胞表达在SPS各组细胞胞质中,各项表达呈逐渐下调趋势。　　 3、透射电镜技术观察蓝斑神经元超微结构改变　　 SPS后,蓝斑神经元发生了超微结构改变,核内染色质浓缩边集。核膜下陷,核皱缩,出现凋亡的特征性结构改变。　　 4、凋亡因子Caspase-12RT-PCR的检测结果　　 SPS刺激后,Caspase-12mRNA表达于1d表达明显增加,4d时表达最多,之后渐趋下降。　　 结论:　　 1、PTSD大鼠蓝斑神经元整合素、缝隙连接蛋白及纽蛋白的表达变化与蓝斑神经元的细胞凋亡相关。　　 2、PTSD大鼠蓝斑神经元各时间段β-catenin的表达呈现逐渐下调趋势,表明Wnt通路是通过β-catenin途径调节蓝斑神经元凋亡的发生。