以Visfatin/Nampt为靶标的活性化合物筛选

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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是生命体内200多种氧化还原反应的辅酶,在很多细胞生理过程中如Ca 2+动员、基因稳定、凋亡、代谢、应激、老化等起着至关重要的作用。Nampt是哺乳动物NAD 合成途径的限速酶,调节着细胞内总的NAD水平和线粒体中的NAD水平。此外,Nampt通过控制NAD的合成维持细胞的能量供应,对细胞生存起到了关键性作用。
   大量研究表明,Nampt在促进细胞分化成熟、参与机体免疫反应和炎症应答、抗细胞凋亡等方面有诸多有益的生理功能,在心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病中有潜在保护作用。在癌症中,肿瘤细胞为了快速增殖,对细胞内NAD水平的依赖比正常细胞更强。研究表明Nampt 有促血管生成活性,支持着一些肿瘤细胞的生长,抑制Nampt 酶活性可起到很好抗肿瘤作用。这使得Nampt 成为近年来药物研究中一个非常有吸引力的靶标。特别是2005年新发现的脂肪细胞因子visfatin 具有Nampt的酶活性,使得visfatin/Nampt 成为全世界生物学功能研究的热点分子。目前有研究报道的Nampt 抑制剂只有4个,尚无任何Nampt 激活剂和以Nampt为靶标的高通量筛选工作报道。为寻找首个Nampt 激活剂,发现更多不同结构类型的新型Nampt 抑制剂,基于本课题组在前期研究中建立的高通量筛选系统,我们展开了以Nampt为靶标的高通量筛选。
   我们利用已建立的筛选平台,对购自上海国家化合物资源中心的15,200多个化合物在20μM浓度下进行初筛,得到激活率在25%以上的化合物747个,抑制率在60%以上的化合物23个。初筛选出的化合物再进行复筛以确认其活性,复筛中增设对照反应组以排除假阳性结果。复筛后选出102个化合物,在20、2、0.2 μM浓度下测定它们的活性,目的在于进一步筛选出活性好、有效浓度低的化合物。在2 μM浓度时抑制率大于50%的化合物共6个,分别是:9882、735、2161、4162、7391、6443。
   我们又深入测定了这6个化合物在体外对Nampt 酶活性的半数抑制浓度IC50值,分别为:3.54 μM、9.87 nM、0.149 μM、0.777 μM、0.855 μM、0.352 μM。筛选实验中的质量控制参数Z ′因子变化范围在0.52~0.88 之间,CV值在0.85~9.02%之间,S/N比值均大于8,符合高通量筛选要求。
   通过初筛、复筛以及对体外酶活性抑制IC50值测定,我们找到6个有潜在Nampt抑制活性的小分子化合物。进一步,在人肝癌细胞株HepG 2上考察化合物733、735、2161、4162、7391对细胞内NAD水平的影响。设置化合物浓度为1、10、100μM,分别孵育HepG 2 肝癌细胞24小时,高氯酸法裂解细胞,酶循环法测定细胞裂解液中NAD水平。结果显示,735在1μM浓度下作用24小时,HepG 2 肝癌细胞内NAD水平降低72.9%(10、100μM时分别为74.04%和77.12%);2161和7391在100μM浓度下作用24小时,HepG 2细胞内NAD水平分别降低60.2%和49.7%;733和4162对细胞内NAD水平的的抑制作用不显著。
   我们选出735作为抗肿瘤研究的潜在活性化合物。进一步测定了735对HepG 2肝癌细胞NAD水平影响的半数抑制浓度IC50值为93.7±3.4 nM。同时,考察了735在0~10μM浓度范围内对HepG 2细胞的毒性,结果显示,735在0~10μM浓度范围内作用于HepG 2细胞24小时,不会引起细胞死亡。而在此浓度范围内,735 又能有效引起HepG 2细胞内NAD水平降低。因此,我们认为,化合物735 没有直接、即时的细胞毒性,而是可能通过抑制Nampt的酶活性,逐渐耗竭细胞内的NAD。
   另外,我们考察了化合物735对人肝癌细胞株HepG 2、人卵巢癌细胞株A2780和人前列腺癌细胞株DU145 体外增殖能力的抑制作用。用梯度浓度的化合物分别作用于对数生长期的细胞株72小时,SRB 法进行检测。结果显示,735对3种细胞株的增殖表现出不同程度的抑制作用,它对人卵巢癌细胞株A2780和人前列腺癌细胞株DU145 增殖抑制的IC50值约为0.3 μM,对人肝癌细胞株HepG 2 增殖抑制的IC50值约为19.3 μM。
   本研究首次开展了以Nampt为靶标的活性化合物筛选工作,通过体外通量化筛选,发现了6个完全不同于已有Nampt 抑制剂的全新结构类型化合物,其中化合物735在细胞水平上表现出较好的活性,但其体内活性还有待进一步确证,其作用机制也需展开深入研究。本研究所得到的先导化合物可以进一步进行结构优化,以期为Nampt的相关研究提供工具,有望发现新的Nampt 抑制剂类抗肿瘤候选药物。
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