鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)属于α-疱疹病毒，是一种泛嗜性全身性感染的病毒，可引起鸭、鹅、雁及其它雁形目禽类的一种急性、接触性、败血性传染病，是目前对养鸭业的一大危害。电子显微学技术是研究病毒形态结构、鉴定新病毒、阐明病毒的发育循环、研究感染宿主病理学的一个重要方法，它在病毒学研究中具有不可替代的作用。相对其它α-疱疹病毒而言，DPV研究的总体水平较低。本文通过人工感染DPV强毒复制鸭瘟(Duck Plague，DP)急性病例，对病毒的形态结构和病毒形态发生学以及病毒在体内的分布情况进行研究，同时观察病毒引起宿主细胞的超微结构变化和诱导宿主细胞凋亡情况，以期系统地了解DPV的入侵方式和复制机理，为阐明鸭瘟的发病机制提供关键的实验数据。dUTP焦磷酸酶是DNA合成中的一种重要的酶，病毒dUTPase在病毒DNA的合成及病毒的复制增殖起重要作用。疱疹病毒dUTPase常与病毒的毒力有关，尤其是与病毒的神经毒力和神经侵袭力以及病毒从潜伏感染状态活化的能力相关。本文在DPV基因文库的大量测序结果中发现一个1344bp的完整dUTPase基因，开展了该基因在DPV基因组的酶切图谱定位研究，并建立基于该基因的区分DPV强毒和弱毒的PCR方法。结果如下：1．鸭瘟强毒致实验感染鸭细胞超微结构变化用DPV CHv强毒株感染成年鸭复制鸭瘟急性病例，分别于接种后不同时间，取心、肝、肾、脾、胸腺、十二指肠、法氏囊、脑和胰组织，制作超薄切片。电镜观察结果表明：DPV感染宿主后，超微结构变化最早发生于肝和肾，而鸭死亡后以免疫器官和消化器官损伤最严重。各种细胞的变化主要为肿胀坏死，表现为细胞肿胀，染色质或浓缩、碎裂或溶解，线粒体肿胀，嵴断裂、溶解至呈空泡样结构，其它细胞器破坏；脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。而鸭死亡后淋巴细胞主要表现为黑洞核样变化，整个细胞凝聚深染，染色质固缩，细胞浆均质深染，细胞膜模糊或不完整。2．鸭瘟强毒在实验感染宿主细胞内的形态发生学电镜观察病毒在宿主体内的分布和形态发生学结果表明：感染后12h在脾脏和法氏囊首先观察到少量的子代DPV出现，24h后在脾、胸腺和法氏囊以及死亡鸭的肝、肠中均观察到具有典型的疱疹病毒粒子及其核衣壳形态的DPV，而在胰腺和大脑组织中也观察到少量的病毒颗粒。DPV病毒核衣壳有空心型、致密核心型、双环型、拟核型和内壁附有颗粒型等多种形态。病毒核内核衣壳通过内外核膜进入胞浆，核内和胞浆内的核衣壳在细胞浆中获得皮层，然后在各种质膜上获得囊膜，最后成熟病毒通过细胞破裂或其他方式释放到细胞外。伴随着病毒的复制、装配和成熟，细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密颗粒、核内微管和中空短管等病毒相关结构。3．鸭瘟强毒致感染鸭淋巴细胞凋亡利用电镜技术观察DPV人工感染宿主细胞超微结构变化时，我们发现了典型的细胞凋亡现象：感染鸭脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞在感染24h后在出现细胞坏死的同时还出现较为明显的细胞凋亡变化。疾病发生过程中，淋巴细胞凋亡数量明显增多。凋亡细胞的形态学变化表现为细胞体积缩小，细胞器结构正常，染色质初期浓集成团，聚集于核膜的周边，随后出现染色质凝聚，核碎裂，细胞膜上出现空泡，带有单位膜结构的凋亡小体形成，凋亡细胞和凋亡小体随即被临近细胞或巨噬细胞吞噬消化。没有被吞噬的凋亡细胞细胞膜逐渐皱缩、溶解。进一步用琼脂糖凝胶电泳(DNAladder)和原位末端标记(TUNEL)方法对DPV致宿主淋巴细胞的凋亡情况进行了检测，感染鸭的胸腺、法氏囊、脾脏出现典型的180-200bp的梯状条带(ladder)，TUNEL染色也在这些组织切片中观察到了棕色的阳性细胞。研究结果表明，DPV感染造成宿主淋巴细胞的坏死和凋亡共同导致淋巴细胞的大量损耗，而淋巴细胞的这种变化可能在鸭瘟的发病机制中起着重要的作用。4．鸭瘟病毒dUTPase基因的发现及分子特征分析选取本实验室构建的DPV DNA基因文库中的一个重组质粒并测序后用NCBI的BLASTN和ORF Finder工具初步分析发现一个全长为1344bp完整ORF片段。通过NCBI的BLASTP分析，初步确定为dUTPase基因(在GenBank注册的登录号为DQ486149)。运用CLUSTALX、DNAstar、SignalP、TMHMM、NetPhos2.0和ESyPred3D等工具对该ORF1344编码蛋白进行了全面的生物信息学分析。结果显示，该基因编码一个447个氨基酸的多肽，没有信号肽切割位点，其分子量理论值约为49.7KD。通过CLUSTALX与Genbank中的dUTPase的氨基酸序列进行比较并构建系统进化树，结果表明：该基因编码的肽链与疱疹病毒的dUTPase有较高的同源性。通过进化树分析表明该肽链与α-疱疹病毒(禽疱疹病毒、马疱疹病毒、牛疱疹病毒和伪狂犬病毒等)编码的dUTPase在遗传上一致。ORF1344编码肽链具有dUTPase蛋白质家族保守区域，抗原性分析表明该肽链上存在多个抗原表位。该蛋白质为一种膜外蛋白，没有跨膜区存在。该蛋白有23个潜在的磷酸化位点，有3个潜在的N-糖基化位点，二级结构中存在5段主要的疏水区域。空间结构分析表明DPV dUTPase肽链中的两个区域的空间结构与Ⅰ型dUTPase的空间结构一致。蛋白质定位分析表明该蛋白主要定位于胞质和胞核中。本研究在国内外首次发现了鸭瘟病毒的dUTPase基因，为DPVdUTPase基因的克隆和后续的DPV分子生物学研究提供了基础数据。5．鸭瘟dUTPase基因克隆和在基因组中的定位研究根据测序和分析结果，设计一对引物DU1／DU2(扩增幅度为1344bp，含完整的DPV dUTPase基因)对DPV基因组DNA进行扩增并克隆到pGEM-T载体上，测序结果表明克隆片断的序列与预期一致。将DPVCHv株经鸭胚成纤维细胞进行培养增殖后，收集病毒液，病毒经初步提纯后提取DNA。采用HindⅢ和SacⅠ限制性内切酶对DPV CHv株基因组进行酶切消化，用标记有生物素的引物进行PCR扩增并获得的dUTPase基因探针，将dUTPase探针与DPV基因酶切条带杂交以进行dUTPase基因在酶切图谱上的定位分析，试验结果证实该基因存在于DPVCHv株基因组HindⅢ酶切的Ⅰ片段上和SacⅠ酶切的M片段上。6．基于dUTPase基因强弱毒PCR方法的建立和应用利用DPV dUTPase引物DU1／DU2，建立基于DPV dUTPase基因的PCR方法。对正常DEF细胞、尿囊液，DPVCHa弱毒株进行扩增，只能在DPV强毒株中能扩增特异性条带，而其它病原体(鸭病毒性肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、鸭沙门氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、小鹅瘟病毒、马立克病毒和鸡传染性喉气管炎病毒)的核酸提取物不能扩增出任何条带。该对引物的灵敏度可达到10pg。应用该PCR方法对15份DPV感染病料进行PCR检测，均能扩增出与预期大小一致的特异性条带。结果表明该方法可应用于临床鸭瘟的诊断与检测和DPV强毒株和疫苗株的PCR鉴别诊断。