生物能源作为一种可再生能源,能够有效地解决能源危机、环境污染和经济的可持续发展等诸多问题。丁醇包括正丁醇和异丁醇,因其较高的能量密度、在运输与储存方式上的安全性与便利性、与乙醇相比的低吸湿性和低腐蚀性、与汽油相近的理化特性以及其作为化工原料的广泛应用前景,得到了世界各国的广泛关注与重视。现阶段生物发酵丁醇生产中面临的主要问题是发酵生产成本居高不下,利用丰富的、廉价的可再生的纤维素生物质生产丁醇是当前的研究热点。本研究针对目前制约纤维原料生物转化正/异丁醇研究中纤维素酶成本高,转化效率低的主要技术瓶颈,考察了粗酶液水解秸秆发酵产正丁醇的效能以及利用微生物的协同作用构建了纤维素直接生物转化正丁醇的共培养体系,同时结合合成生物学的指导思想,构建了纤维素直接生物转化异丁醇的基因工程菌,并对其稳定性及效能进行了分析,论文取得主要研究成果如下:针对纤维素糖化发酵生产正丁醇过程中纤维素酶的高成本、低活性问题,采用绿色木霉(Trichoderma viride)的胞外粗酶液进行纤维素基质的酶解糖化。通过中心组合响应面法优化粗酶液水解纤维素条件,在p H 5.1、水解温度50.7°C、纤维素酶添加量41.1 U/g、底物浓度38.1 g/L条件下,粗酶水解液中还原糖含量为17.32g/L,糖化率为62.42%,其糖化效率达到了商品酶R10的82.3%。利用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicium)ATCC824对粗酶水解液进行发酵生产正丁醇,研究表明在分步糖化发酵工艺中正丁醇产量,产率和生产速率分别为7.05 g/L、0.155g/g底物和0.141 g/L·h;在同步糖化发酵工艺中正丁醇终浓度为5.05 g/L,产率和生产速率分别为0.127 g/g底物与0.080 g/L·h。该结果证实低成本的纤维素酶粗酶液替代商品酶进行高效纤维素水解糖化及正丁醇的发酵生产具有可行性,为纤维素基质转化正丁醇发酵生产过程的成本降低提供了一个新思路。根据微生物间的协同效应的原理,并结合现有共培养体系研究中各组分菌株生长及作用条件不匹配问题,分别选用本实验室前期富集筛选得到的中温厌氧纤维素降解菌系N3和速生梭菌(Clostridium celevecrescens)N3-2,建立了复合菌系N3和速生梭菌(C.celevecrescens)N3-2与产正丁醇菌株丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicium)ATCC824的共培养体系。在37°C中温培养条件下共培养体系N3+ATCC824和N3-2+ATCC824降解纤维素产正丁醇能力分别为3.73 g/L和2.69 g/L,正丁醇产率分别为0.145 g/g底物和0.134 g/g底物。该研究结果为在中温厌氧条件下实现纤维素直接生物转化生产正丁醇提供重要的理论依据和参考价值。针对目前尚未发现有原始菌株可以直接合成异丁醇以及现有异丁醇基因工程菌株无法利用纤维素基质直接转化异丁醇的研究现状,构建了一株能够高效降解纤维素发酵生产异丁醇的工程菌株。首先通过纤维素降解菌株的筛选,得到一株能够高效降解纤维素的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)W12。异丁醇耐受性分析发现W12菌株较其他常见基因工程宿主菌株具有更高的异丁醇耐受能力。在此基础上,利用大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒p MA5,将aro10与adh2两个基因转入W12菌株中得到工程菌株W12-RD,发酵试验检测其异丁醇产量为0.126 g/L,初步实现了利用Ehrlich途径合成异丁醇的能力。研究发现不同的基因连接顺序会影响特定基因的相对表达量,进而影响了异丁醇产量。通过在发酵体系中添加不同的Ehrlich途径前体物质,W12-RD菌株能够合成对应的醇类,验证了该方法的普适性,同时研究发现Ehrlich途径的合成具有竞争性。为了进一步提高异丁醇的产量,我们对异丁醇合成前体2-酮异戊酸合成关键基因als S进行过表达,并敲除pta与pfl B基因,以阻断丙酮酸旁路消耗。得到工程菌株W12-C2B,采用联合生物加工工艺进行纤维素基质转化异丁醇的一步法发酵生产,最终异丁醇产量为1.310 g/L、异丁醇产率及最高生产效率分别为0.074 g/g底物和0.007 g/L·h。