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深色有隔内生真菌(dark septate endophyte,DSE)在重金属污染环境生长植物的根系上广泛定殖,越来越多的研究表明DSE能增强宿主植物的重金属耐性,而DSE自身通常也对重金属表现出较强的耐性。ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)是一类普遍存在于生物细胞内、功能多样的超家族转运蛋白,在提高宿主生物和非生物胁迫耐性方面发挥着重要作用。本文以分离自云南重金属矿区、对Pb、Zn、Cd具有较强耐性的DSE菌株——嗜鱼外瓶霉Exophiala pisciphila为材料,以Cd2+胁迫和无镉胁迫对照组E.pisciphila转录组数据为基础,首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对转录组数据中注释为ABC转运蛋白的基因,在EC50值Pb2+、Zn2+、Cd2+浓度胁迫下,对上调表达的基因进行筛选;然后对确定为研究对象的ABC基因进行生物信息学分析;在此基础上,分析了Pb2+、Zn2+、Cd2+系列梯度浓度胁迫下,目标基因的表达响应模式;采用荧光免疫技术对ABC目标基因进行亚细胞定位;利用酵母(Saccharomyces cerevijsiae)异源表达进行ABC基因功能验证;应用花序浸染法将ABC基因转到拟南芥(Arabidopsisthaliana)中超表达,从而对ABC转运蛋白在提高宿主重金属胁迫耐性中的作用及机制进行分析;研究获得以下结果:1.基于转录组数据分析,E.pisciphila共有42条ABC转运蛋白基因序列,分属于4个亚族,分别为ABCB、ABCC、ABCD和ABCG。根据Pb、Zn和Cd EC50值浓度胁迫下,ABC转运蛋白基因相对表达量,确定了 EpABC1、EpBC2和EpBC3作为本实验目标基因;生物信息学分析表明,EpABC1 ORF长度为2127 bp,等电点为8.90、蛋白分子量为80.91 KDa,为半型ABC转运蛋白,属于ABCD亚族;EpABC2ORF长度为2601 bp,等电点为5.65、蛋白分子量为96.23 KDa,为半型ABC转运蛋白,属于ABCB亚族;EpABC3ORF长度为4659bp,等电点为8.07、蛋白分子量为172.791 KDa,为全型ABC转运蛋白,属于ABCC亚族。EpABC2和EpABC3具备相应的特征性跨膜域结构,EpABC1则没有跨膜域;3者均没有信号肽;3个基因的亚细胞定位预测分别为液泡或过氧化物酶、液泡或细胞核、液泡或细胞质膜。2.在Pb2+、Zn2+、Cd2+梯度浓度胁迫下,E.pisciphila EpABC1、EpABC2和EpABC3均可响应重金属离子的胁迫,且上调表达,但3个基因的表达特征因重金属的种类而略有不同。在Pb2+、Zn2+梯度浓度胁迫下,3个基因相对表达量随着金属离子浓度的升高而升高,最高表达量分别为无重金属胁迫的13.3倍、30.7倍和26.8倍,3.7倍、21.7倍和5.6倍;在Cd2+梯度浓度胁迫下,3个基因相对表达量的变化趋势一致,先随着Cd2+浓度的升高而升高,在EC50值浓度下(111.20 mg/L)达到最大值(分别为8.6倍、9.6倍和29.3倍,与对照差异显著),之后逐步下降。纵向比较发现,EpABC2和EpABC3响应3种重金属胁迫敏感性高于EpABC1,推测EpABC2、EpABC3在提高E.pisciphilaPb、Zn、Cd耐性中发挥着更加重要的作用。3.免疫荧光亚细胞定位实验显示,EpABC1、EpABC2和EpABC3 3条基因均定位在细胞质中,且荧光信号强,在细胞质中大量表达。4.EpABC1、EpABC2和EpABC3酵母异源表达实验结果显示,在不同浓度的Pb2+、Zn2+、Cd2+胁迫下,导入目的基因的无论是野生型转化子还是敏感菌株转化子,其生长状况均显著优于导入空载的转化子,表明EpABC1、EpABC2和EpABC3异源表达可以明显提高酵母转化子的Pb、Zn、Cd胁迫耐性。导入EpABC2和EpABC3基因的野生型转化子WT-EpABC2、WT-EpABC3中Pb、Zn、Cd的含量均显著高于空载野生型转化子WT-pYES2;而EpABC1基因野生型转化子(WT-EpABC1)中重金属含量则低于空载野生型转化子,提示着EpABC1与EpABC2和EpABC3重金属解毒机制不同;就增强酵母重金属耐性面言,EpABC2和EpABC3效果优于EpABC1。5.3个目标基因都成功转入到拟南芥中,其中EpABC3转基因拟南芥稳定继代(获得了 T3代纯系植株),而EpABC1和EpABC2仅在T1代转基因拟南芥中表达。EpABC2和EpABC3转基因拟南芥均可响应Cd胁迫,能显著提高转基因植株的Cd耐性,且EpABC3效果更好;Cd能在WT-EpABC2、WT-EpABC3超表达植株中积累,与对照相比差异显著。EpABC1对Cd2+胁迫响应不敏感,不能提高转基因植株的Cd耐性。此外,3条基因均可显著提高超表达植株的生物量。本文首次明确了 ABC转运蛋白在DSE(E.Pisciphla)耐重金属胁迫中的作用,初步阐明了EpABC1、EpABC2和EpABC3的分子结构及其增强宿主重金属耐性的作用机制,为从分子水平探讨DSE重金属耐性机制提供了理论依据和研究方法借鉴,同时也为DSE重金属耐性基因资源发掘和重金属耐性农作物转基因育种提供了理论和技术支撑;对利用转基因植物治理土壤重金属污染具有理论和实践意义。