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胞苷是化学合成多种抗病毒、抗肿瘤药物的中间体,有重要的应用价值。本文对产胞苷枯草芽孢杆菌的基因工程育种,进行了初步研究。本研究以枯草芽孢杆菌168为出发菌株,在其染色体araR基因位点,引入了一个受AraR蛋白调控的新霉素抗性基因构成的反向选择盒,构建了菌株ZY10N,用作无标记基因修饰,构建产胞苷基因工程菌的出发菌株。在ZY10N菌株中,敲除了胞苷脱氨酶基因(cdd),构建了菌株ZY11C。然后分别以cdd、hom、pyrR基因缺失和prs基因强表达菌株ZY41PRS,cdd、hom、pyrR、pdp-nupC基因缺失和prs基因强表达菌株ZY51PRS为出发菌,以pyrG基因组成型表达为目的,修饰了其转录起始区,获得了pyrG基因转录起始位点、前导区和编码序列发生不同点突变的重组菌株ZY42G3、ZY42G9、ZY42G12、ZY52G3和ZY52G9。摇瓶培养显示,出发菌的最大生长OD值为9.38,ZY42G系菌株的最大生长OD值分别为8.72、7.2、10.84,表明pyrG基因表达状态改变会影响菌株生长能力。ZY42G系菌株分别产胞苷42.6μg/mL、56.6μg/mL、33.4μg/m L,比出发菌分别提高了63.8%、117.7%、28.5%。尿嘧啶产量分别为533.4μg/m L、439.1μg/m L、314.4μg/m L;尿苷最大产量出现在发酵20-30h,产量分别为25.9μg/m L、26.3μg/m L、23.5μg/m L。结果显示,转录起始区点突变改变了pyrG基因表达状态,编码序列的点突变改变了CTP合成酶的活性,胞苷产量与pyrG基因表达状态和CTP合成酶的活性有相关性。ZY52G系菌株摇瓶发酵显示,其生长能力没有显著变化;在发酵液中均未检测到尿嘧啶;胞苷产量均为27μg/m L左右,较出发菌下降44%。尿苷产量均为600μg/m L左右,较出发菌下降约33%。这一结果表明,在pdp-nupC基因缺陷背景下,改变pyrG基因的表达状态不利于嘧啶核苷的过量合成。为了构建pyrG基因高表达菌株,用gsiB mRNA稳定子修饰了pyrG基因的mRNA前导区,构建了同源重组片段,并转化ZY51PRS菌株。虽然能够得到转化片段与染色体双交换重组的中间菌,但是不能得到染色体内同源重组的转化子。结果表明,在pdp-nupC基因缺失背景下,高表达pyrG基因,可能导致细胞死亡。