背景 肝脏疾病危害人类健康,肝功能衰竭、重型肝炎和肝癌等疾病的死亡率高达 65%-85%,虽然原位肝脏移植在一定程度上可以缓解病情,帮助病人度过危险期,但是由于肝脏器官来源匮乏,术后免疫排斥反应和巨额的手术治疗费用等因素,都使得这一治疗措施不能广泛的应用。 肝脏组织工程( Engineering Liver Regeneration)是近年来正在兴起的,由生物学、医学、材料科学、生物医学工程学等学科交叉产生的一门高新技术学科,最终的目标是永久性的修复和取代人类病损的肝脏组织,从而彻底的治愈肝脏疾病,这为肝脏疾病的治疗开辟了全新的思路。肝脏组织工程研究包括种子细胞的研究、细胞外基质的研究和组织器官的构建等三部分。其中,种子细胞选取,是一切研究的基础。随着人们对干细胞研究的逐步深入,选取干细胞作为种子细胞越来越为人们所关注,尤其是自体干细胞。已经有研究表明骨髓来源的干细胞具有多向分化潜能,在体外可以分化为骨、软骨、肌肉、神经、脂肪细胞和肝细胞等。在骨髓中存在两种主要的干细胞:造血干细胞(Hematopoietic stem cell HSCs)和间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells MSCs),已经有研究表明:间充质干细胞在体外不同条件下可以定向的被诱导分化为成骨细胞[1]、成软骨细胞[2]、脂肪细胞[3]、肌肉细胞[4]、神经元细胞[5]等不同细胞,因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能以及取材方便、自体植入后不良反映较弱等优点,将成为肝脏组织工程的理想种子细胞。 目前,MSCs 在骨、软骨、和肌腱损伤的修复方面研究比较深入,但在体外向肝细胞诱导分化的条件和机制方面刚刚起步,而且面临一系列的困难:如何模拟体内微环境使骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化;如何提高诱导分化效率;建立高效完整的扩增体系等。 研究目的 探讨 MSCs 在体外是否具有定向分化为功能性的肝细胞的潜能。 方法与结果 本实验第一部分首先分离、培养并鉴定 MSCs。利用骨髓间充质干细胞的密度特性,用一定密度的 Percoll 对提取出的骨髓进行密度梯度分离。1.073g/mL 密度梯度离心法结合贴壁法分离小鼠骨髓间充质干细胞,经传代培养后,取第 3 代的 MSCs,观察不同的血清浓度、种植密度对细胞体外生长的影响,观察细胞生长曲线,并应用流式细胞仪检测细胞表面抗原。第 3 代的 MSCs 经过流式细胞仪鉴定发现:培养的第 3 代 MSCs,干细胞表面标志 CD90 阳性,基质细胞表面标志 CD44 阳性,不表达内皮细胞表面标志 CD31 不表达白细胞表面标志 D45;不表达造血干细胞表面标志 CD34。说明在第 3 代的 MSCs中不含有造血干细胞,其他杂质细胞含量少,已经成为比较纯的MSCs.,为下一步的实验奠定基础。 本实验第二部分探讨 MSCs 是否具有定向肝细胞分化的潜能。取第 3 代骨髓间充质干细胞,0.25%胰酶消化,台盼兰拒染试验显示细胞活率大于 95%,以 1×105/mm 的密度种植在 24 孔和 6 孔培养板中。约 7-12 天,细胞铺满板底。单独应用 HGF、EGF 及 HGF 联合 EGF对 MSCs 进行诱导,各组加入诱导因子后,MSCs 分裂增殖逐渐停止,开始有少量细胞发生形态学的改变,梭形细胞的两极开始回缩,细胞开始由梭形变圆。其中 HGF 和 EGF 联合诱导组的 MSCs 在 48h内就部分细胞变圆;而单独应用 HGF 组和单独应用 EGF 组在 48h 内细胞无明显改变,而在 72h 后可以发现有部分细胞变圆;诱导 10 天后,各组变圆细胞均有“聚集”现象出现。诱导分化 20 天,各组细