随着经济社会的发展,女性受教育程度的提高,婚育年龄逐渐推迟,高龄生育逐渐增加成为一个社会问题。特别是我国全面二胎政策的开放,高龄生育已经成为一种社会趋势,越来越受到社会各界的重视。高龄生育除了对于产妇本身和生育结局具有不利影响外,同时也对婴幼儿的生长发育具有负面作用。但是,众多研究报道中,母亲高龄生育对子代神经发育和智力的影响尚存在争议。本实验室已采用Morris水迷宫实验证明雌鼠高龄生育子代的学习记忆能力比适龄生育子代较低,并通过基因芯片、q RT-PCR和Western blot证明一系列基因在雌鼠高龄生育子代新生期海马中差异性表达。为了进一步探讨高龄生育对子代生长发育,特别是对神经智力方面的影响,我们拟采用q RT-PCR法和免疫印迹法检测雌性高龄生育子代海马发育过程中S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)基因动态表达特性,及Skp2下游底物蛋白p27和p21表达特性。同时我们也记录比较了高龄生育子代与青年生育子代发育过程中的相关指标和成年海马组织内神经发育相关基因的表达特性,在分子水平上进一步探索高龄生育对子代海马发育的影响。目的研究雌鼠高龄生育对子代发育过程中相关发育指标和海马组织内Skp2及p21、p27的影响,观测成年后海马组织内神经发育相关基因的表达特性,探讨其在海马神经发育过程中的作用,以及对子代的成年后的学习、记忆、认知的可能影响。方法方法1.实验动物和分组:选用清洁级SD(Sprague Dawley)大鼠(购自郑州大学实验动物中心)。青年雌鼠(3月龄)和高龄雌鼠(12月龄)。分别同随机选择的青年雄鼠(3月龄)合笼,所生仔鼠分别为青年组和高龄组。2.生育能力检测:记录合笼-分娩天数、每窝产仔数和雌雄比例。3.仔鼠发育过程中体重的检测:记录仔鼠出生第1、3、7、14、21、28、60天的体重。4.Skp2及相关基因的检测:仔鼠出生第1、3、7、14、21、28、60天处死后取海马组织,通过实时荧光定量PCR法检测Skp2 m RNA表达,通过免疫印迹法检测Skp2及其底物p27、p21蛋白的表达。5.成年子代海马内学习记忆相关基因的检测:通过实时荧光定量PCR法检测海马内神经发育相关基因Edn1、Hspa4、Fos、Bcl2、Grin1 m RNA表达。6.统计学分析:用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。对于青年组和高龄组体重变化采用单因素方差分析。对于两组仔鼠雌雄比例、发育过程中各时间点的发育指标及Skp2的表达量采用独立样本的t检验。检验水准取α=0.05。结果1.雌鼠生育能力:青年雌鼠和高龄雌鼠分别同随机选择的青年雄鼠合笼,高龄组的合笼至分娩天数比青年组显著增加,产仔数则明显降低(P<0.01),两组子代雌雄比例无显著差异(P>0.05)。2.仔鼠发育过程中体重检测:分别在仔鼠出生后第1、3、7、14、21、28、60天记录体重。发现仔鼠出生后体重随时间的推移显著增加,高龄组与青年组在各个时间点体重差异无统计学意义(P>0.05)。3.发育过程中Skp2、p27和p21表达检测:高龄组和青年组子代海马内Skp2的m RNA表达量随发育时间的延长而下降。高龄组中第7天Skp2的m RNA表达显著低于青年组(P<0.05),其余各时间点两组间无显著性差异(P>0.05)。高龄组和青年组中Skp2的蛋白表达量均随发育时间的延长逐渐下降,出生第1~14天两组间无显著差异(P>0.05),第21~60天高龄组子代海马中Skp2表达显著高于青年组(P<0.05);高龄组和青年组中p27的蛋白表达量随发育时间的延长逐渐下降,两组间无显著差异(P>0.05);高龄组和青年组中p21的蛋白表达量随发育时间的延长增加,高龄组第28、60天p21表达显著高于青年组(P<0.05)。4.高龄组成年子代海马内神经功能的相关基因m RNA检测:高龄组成年子代(60天)海马内Edn1和Hspa4的表达量均显著低于青年组(Edn1 P<0.05,Hspa4 P<0.01),Fos、Bcl2和Grin1的表达量则无显著差异(P>0.05)。结论1.Skp2和p21可能是雌鼠高龄生育对子代神经功能及学习和记忆的影响因素,但Skp2-p27/p21调控不是高龄生育对子代海马神经发育的调控方式。2.高龄组成年子代海马内Edn1和Hspa4的m RNA呈低表达状态,可能与高龄生育子代神经功能改变相关。