第一部分 胰腺神经内分泌肿瘤的外科治疗及预后分析引言:胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumors,PNETs)是一类较为少见的胰腺肿瘤,约占胰腺肿瘤的1～3%,年发病率约1/10万。近年来,随着计算机断层扫描及磁共振成像影像技术的发展,尤其是内镜超声下细针穿刺活检技术的成熟,PNETs的检出率与确诊率在不断提高,同时PNETs的治疗也越来越受到关注。PNETs的治疗包括手术治疗、化疗、生物治疗、分子靶向治疗等多种治疗方法。但目前由于化疗细胞毒性大,又缺乏专门针对胃肠胰腺中某一特定部位神经内分泌瘤的大型Ⅲ期多中心化疗药物对照研究,因此仅适用于缺乏其他临床治疗方案的进展期患者。而对于奥曲肽等生物治疗是否具有抗肿瘤作用仍存在争议。分子靶向药物的作用也有待进一步研究。因此,目前手术治疗被认为是PNETs的主要治疗手段,也是目前唯一可能治愈这类疾病的方法。Hill等回顾性研究了728例PNETs患者,发现425例具有手术指征,最终310例接受了根治性手术,对于早期和中晚期PNET患者,与非手术治疗相比,接受手术治疗可以带来明显的生存获益(平均总生存时间分别为114个月与35个月)。McEntee等研究发现PNETs即使存在转移,也应争取行根治性切除或姑息性手术治疗,这样能减少后续的相关治疗。对于存在局部进展或广泛转移的PNET患者,减瘤手术也可以使患者生存质量与生存时间得到提高。鉴于手术治疗在PNETs患者中的重要性,我们选取在本院接受手术治疗的PNETs患者进行预后研究。PNETs的手术方式主要有肿瘤剜除术及规则性切除术(胰腺中段切除术、胰体尾切除术、胰十二指肠切除术或全胰切除术)。手术方式的选择与多种因素相关,包括肿瘤的类型、大小、部位与主胰管的关系等。剜除术的优点是保留了正常胰腺组织,但可能会造成肿瘤残留,且胰瘘的发生率明显增加。然而行规则性切除可能起到更好的肿瘤根治性,但存在损失过多正常胰腺组织的缺点。Falconi等比较了24例接受剜除术和26例接受中段胰腺切除术的PNETs患者的疗效,平均随访68个月,8%的患者出现局部复发,两组肿瘤复发率的差异无统计学意义,但中段胰腺切除术后的手术并发症发生率更高。我们将在研究中比较不同手术方式的PNETs患者预后情况。除了手术与否被证实与预后密切相关外,学者们也对肿瘤的分级、分期、大小、Ki-67指数、淋巴结转移、远处转移及患者性别等与PNETs预后的相关性进行了研究。Bettini的一项对1990年至2008年经手术根治切除的230例无功能性胰腺神经内分泌肿瘤(NF-PNET)病人的回顾性研究,发现肿瘤的大小与分期、淋巴结转移与生存时间密切相关。而Bahra等对1989年至2003年的19例PNET的回顾性分析中,发现淋巴结转移不是影响NF-PNET生存的重要因素(P=0.81)。Rindi等对1072例PNETs患者的研究中发现性别是PNET无瘤生存率的重要预后因素,但Shin的研究却不支持该结果。此外,对于肿瘤直径较小的PNETs是否行手术治疗也尚存争议。部分学者认为对于肿瘤最大径≤2cm,如无明显手术禁忌证均应积极手术治疗,但也有部分学者主张保守治疗,并进行定期随访。如Lee等对77例中位肿瘤最大径为1.0cm的NF-PNET患者随访观察45个月,发现肿瘤大小没有增大,疾病无进展,而与其对比的接受手术的另外56例NF-PNET患者均出现不同程度的胰漏等并发症,因此其认为偶然发现、最大径<1.0cm、无症状,在综合考虑手术风险、肿瘤部位和患者伴发疾病后,可以密切临床观察。可见,对于PNETs的预后,不同人群的研究,其结论存在较大分歧,而且目前我国国内对于PNETs的预后研究较少,因此,本研究回顾性分析我院经手术切除的PNETs,旨在于探讨该病的临床病理特点、手术方式及其与预后的相关性。方法:1.研究对象选取浙江大学医学院附属第一医院2002年9月～2013年9月间接受外科治疗、并经病理确诊的PNET患者作为研究对象。2.研究内容(1)收集患者年龄、性别、临床表现、手术方式等资料。(2)比较不同手术方式患者间手术时间、术中出血量、术后住院天数、术后并发症的差异。手术方式根据肿瘤的位置和大小可分为局部剜除术(enucleation,EN),胰体尾切除术(distal pancreatectomy,DP)保留或不保留脾脏,胰十二指肠切除术(pancreaticoduodenectomy,PD)。(3)分析肿瘤的相关情况:肿瘤位置、肿瘤大小、Ki-67指数,肿瘤分期及分级、淋巴结转移等。Ki-67指数:用MIBI抗体,在核标记最强的区域计数500～2000个细胞的阳性百分比。肿瘤侵犯分期:根据Kim SJ的研究,将PNETs分为局部期,区域侵犯期和远处转移期。局部期即肿瘤局限在胰腺中;区域侵犯期即肿瘤侵犯周围脏器或组织;远处转移期即肿瘤合并存在远处转移。(4)分析患者年龄、性别、临床表现、手术方式、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分期及分级、Ki-67指数、淋巴结转移等各因素与总体生存期、无瘤生存期之间的相关性。总体生存期(overallsurvival,OS):自疾病确诊至患者因该病死亡或已知的最后1次随访之间的时间;无瘤生存期(disease-free survival,DFS):自疾病确诊至发生局部复发或远处转移之间的时间。3.统计学方法应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用t检验对计量资料进行比较,计数资料采用卡方检验。本研究采用log-rank检验绘制Kaplan-Meier曲线,并采用Cox回归来进行单变量和多变量分析,进行生存分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.入组104例患者,男性49例,女性55例,患者年龄中位数为52岁(19～76岁)。其中临床表现为腹痛31例(29.8%),头晕及低血糖28例(27%),黄疸4例(3.8%),腹泻2例(1.9%),腹部不适9例(8.7%),无症状30例(28.8%)。2.所有患者均接受手术治疗,胰体尾切除术55例(52.9%),胰十二指肠切除术32例(30.8%),胰腺肿块剜除术17例(16.3%)。患者年龄平均值为51.9岁,术式的选择和患者的年龄无明显关系;估计术中出血量为302.2±41.5ml,其中PD组的术中出血明显多于其他2组(P<0.001,P<0.001),EN组的出血量明显小于其他组(P<0.001,P<0.001)。手术时间4.9±1.7小时,其中PD组的手术时间明显长于其他组(P<0.001,P<0.001);术后住院时间16.1±2.7天,其中PD组的术后住院时间明显长于DP,EN组(P<0.001,P<0.001)。全部患者无手术相关性死亡。术后70例患者恢复良好,住院期间无明显并发症。另外34例出现了并发症,其中最常见的是胰瘘,术后感染,胃排空延迟,腹腔出血等。PD组的胰瘘发生率最高(31.25%),但与DP与EN组相比,未见明显显著性差异(P=0.33,P=0.3);PD组的胃排空延迟发生率最高(12.5%),明显高于DP组(P<0.05)。3.肿瘤位于胰头/颈部49例,胰体部17例,胰尾部38例。肿瘤直径为0.8～19.0cm,中位数为3cm。大部分PNETs的WHO分级为G1和G2(93.3%);而按侵犯程度分期主要为局部期和区域侵犯期(92.3%)。8例患者在发现PNETs时存在肝转移,而随访过程中有17例患者出现远处转移,如肝转移,淋巴结转移及肺部转移等,其中以肝转移为主。术后病理提示20例患者存在淋巴结转移。4.1,3及5年的总体生存率分别为95%,85%和73%。1,3及5年的无瘤生存率分别为86%,72%和68%。单因素分析发现肿瘤WHO分级及肿瘤侵犯程度分期是OS及DFS的重要预后因素(P<0.001)。其次,高Ki-67指数及淋巴结转移也是OS及DFS的重要预后不良因素(P<0.001)。是否根治切除也显著影响OS(P<0.001),但手术方式与PNETs的预后无明显相关。5.多因素分析发现肿瘤分级,肿瘤侵犯程度分期,Ki-67指数,淋巴结是否转移及是否根治切除是总体生存率的重要预后因素(P均<0.05)。同时,肿瘤分级,肿瘤侵犯程度,Ki-67指数,淋巴结是否转移是无瘤生存率的重要预后因素(P均<0.05)。结论:1.PNETs手术根治切除可获得较好的长期生存,但手术方式(胰体尾切除术,胰十二指肠切除术及肿瘤剜除术)与PNETs的预后无关。2.肿瘤WHO分级,肿瘤侵犯程度,Ki-67指数,淋巴结是否转移是PNETs总体生存率及无瘤生存率的重要预后因素。准确详细的病理学评估对指导临床治疗和提示预后有重要的意义。第二部分 胰腺神经内分泌肿瘤中MMP-9及DJ-1表达与预后的相关性引言:随着对胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic neuroendocrine tumors,PNETs)的深入研究,发现其具有恶性特征,长期随访可发现,神经内分泌肿瘤具有从惰性的缓慢增长、低度恶性至具有高转移性等较明显恶性的一系列生物学进展行为。近年来,随着其发病率的逐渐增加及临床诊断水平的不断进步,PNETs的检出率与确诊率正在不断提高。然而PNETs的症状复杂多样,临床医师对其认识普遍不足,常发生误诊和漏诊,导致病程迁延,由良性发展成恶性,给患者带来严重的健康损害。目前临床上对PNETs的诊断主要借助于影像学及血清神经内分泌标志物检测等手段,但不易判断其严重程度及提示预后。因此,筛选能提示PNETs严重程度及预后的新型分子标志物成为该研究领域的热点。基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein 9,MMP-9)作为MMPs家族成员,主要诱导新生血管形成、降解基底膜和细胞外基质,促进肿瘤生长和扩散。有研究结果发现,在正常组织中MMPs没有表达,或仅有较弱水平的表达;与良性肿瘤及正常组织相比,MMPs在恶性肿瘤细胞中的表达明显提高。Maatta等研究发现MMP-2及MMP-9的mRNA在肝癌组织中表达升高,并与肝癌恶性程度及预后密切相关。Chen等研究发现通过慢病毒介导RNA干扰敲除HMGB1基因表达,可显著下调MMP-9表达,诱导卵巢癌细胞凋亡,抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭,表明HMGB1和MMP-9与肿瘤细胞的高侵袭性相关。DJ-1蛋白作为一种多功能蛋白,表达于人体各种组织,尤以睾丸、胰腺、肾、心、骨骼肌等组织中表达量较高,与多种肿瘤发生及预后相关。AMOUK等研究发现,DJ-1蛋白在宫颈癌组织中高表达,认为DJ-1蛋白可作为宫颈癌潜在病变期的检测标志物。Yuen等对81例食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织、31例的非癌食管上皮组织和18例发生淋巴结转移的病灶中DJ-1表达进行分析,结果证实食管鳞癌和淋巴结转移灶中胞浆DJ-1表达较非癌上皮增高。此外,DJ-1在前列腺癌表达较前列腺良性增生上调,DJ-1可能是鉴别良恶性前列腺肿瘤的良好生物标记。尽管目前研究已发现MMP-9及DJ-1在多种肿瘤组织中高表达,且与肿瘤发生、发展、转移及预后密切相关。但对于PNETs中MMP-9及DJ-1表达水平及其与临床病理参数相关性等研究较少。本研究旨在检测PNETs患者中的MMP-9及D J-1的表达特征,并探讨其在PNETs病程进展及预后中的临床意义,判断MMP-9及DJ-1可否作为PNETs的新型分子标志物。方法:1.研究对象浙江大学医学院附属第一医院2012年1月～2014年1月接受外科治疗、并经病理确诊的PNETs患者作为研究对象。2.研究内容(1)资料收集:PNETs患者的年龄、性别、临床表现、手术方式、肿瘤大小、肿瘤位置、Ki-67指数,肿瘤分级、治疗及预后情况等临床病理资料。手术方式根据肿瘤的位置和大小可分为局部剜除术,胰体尾切除术(保留或不保留脾脏),胰十二指肠切除术。(2)应用免疫组化染色检测PNETs患者肿瘤组织中MMP-9及DJ-1蛋白表达情况。(3)分析MMP-9及DJ-1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、手术方式、淋巴结转移、远处转移及肿瘤分级等临床病理参数的相关性。(4)分析MMP-9及DJ-1表达水平与患者的无瘤生存率(DFS)的相关性。DFS的定义同第一部分。3.统计学方法应用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。MMP-9及DJ-1表达强度与临床、病理等的关系采用χ2检验,采用log-rank检验绘制Kaplan-Meier曲线,并采用Cox回归来进行单变量和多变量分析,进行生存分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.入组40例PNETs,其中男性16例,女性24例;患者年龄中位数为53岁(29～77岁)。其中临床表现为腹痛11例(27.5%),头晕及低血糖7例(17.5%),黄疸1例(2.5%),腹泻及腹部不适4例(10%),无症状17例(42.5%)。肿瘤位于胰头部10例,胰体部8例,胰尾部22例。所有患者均行根治性切除治疗,其中胰十二指肠切除术7例,胰腺肿块剜除术6例,胰体尾切除术27例(其中4例合并肝转移瘤切除)。肿瘤直径为0.8～8.0cm,中位数为4cm。大部分PNETs的WHO分级为G1和G2(92.5%)。术后病理提示7例患者存在淋巴结转移。PNETs出现复发及远处转移12例,如肝转移,淋巴结转移及肺部转移等,其中以肝转移为主。2.40例PNETs组织中,有19例MMP-9(47.5%)呈阳性表达;有21例DJ-1蛋白(52.5%)呈阳性表达。与无淋巴结转移的组织相比,在发生淋巴结转移的PNETs组织中,MMP-9及DJ-1表达水平显著增高(P=0.026,P=0.006);同样与无远处转移的组织相比,在发生远处转移的PNETs组织中MMP-9及DJ-1表达水平亦显著增高(P=0.027,P=0.006);与WHO分期为G1的组织相比,G2/G3期的PNETs组织中MMP-9及DJ-1表达水平显著增高(P均=0.027)。此外,MMP-9及DJ-1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小及手术方式等临床病理参数之间无显著相关性(P>0.05)。3.患者1年及3年总体生存率分别为98%和94%。同时1年及3年的无瘤生存率为84%和71%。单因素分析结果发现,淋巴结转移情况、远处转移、WHO分级、MMP-9及DJ-1表达水平均与患者的DFS显著相关(P均<0.05)。4.多因素分析发现淋巴结转移情况(HR=10.6,95%CI2.24-50.16)、远处转移(HR=9.76,95%CI 1.21-78.46)和WHO分级(HR=5.77,95%CI 1.22-27.21)是影响DFS的独立风险因素(P均<0.05)。结论:MMP-9及DJ-1在PNETs中高表达,且在其恶性生物学行为中起重要作用,高表达者肿瘤恶性程度高、更易于向周围侵袭。